मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके स्व-इकट्ठे सेल शीट संस्कृति और 3 डी कण्डरा / स्नायुबंधन जैसे अंग के मैनुअल जनरेशन का प्रदर्शन
Summary
इसमें, हम एक तीन-चरण ऑर्गेनॉइड मॉडल (दो-आयामी [2 डी] विस्तार, 2 डी उत्तेजना, तीन आयामी [3 डी] परिपक्वता) का प्रदर्शन करते हैं जो कण्डरा मौलिक अनुसंधान के लिए एक आशाजनक उपकरण और कण्डरा ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक संभावित मचान मुक्त विधि प्रदान करता है।
Abstract
टेंडन और लिगामेंट्स (टी/एल) मजबूत पदानुक्रमित रूप से संगठित संरचनाएं हैं जो मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम को एकजुट करती हैं। इन ऊतकों में एक कड़ाई से व्यवस्थित कोलेजन प्रकार I-समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (ECM) और T/L-वंश कोशिकाएं होती हैं जो मुख्य रूप से समानांतर पंक्तियों में स्थित होती हैं। चोट के बाद, टी / एल को उच्च विफलता जोखिम और अक्सर असंतोषजनक मरम्मत परिणामों के साथ पुनर्वास के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। टी / एल जीव विज्ञान अनुसंधान में हाल की प्रगति के बावजूद, शेष चुनौतियों में से एक यह है कि टी / एल क्षेत्र में अभी भी एक मानकीकृत भेदभाव प्रोटोकॉल का अभाव है जो इन विट्रो में टी / एल गठन प्रक्रिया को पुनरावृत्ति करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, मेसेनकाइमल अग्रदूत कोशिकाओं की हड्डी और वसा भेदभाव के लिए केवल मानक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति और विशिष्ट उत्तेजना मीडिया के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है। उपास्थि के भेदभाव के लिए, तीन आयामी (3 डी) गोली संस्कृति और टीजीएफ के पूरक आवश्यक है। हालांकि, कण्डरा के लिए सेल भेदभाव को एक बहुत ही व्यवस्थित 3 डी संस्कृति मॉडल की आवश्यकता होती है, जो आदर्श रूप से गतिशील यांत्रिक उत्तेजना के अधीन भी होना चाहिए। हमने एक स्व-इकट्ठे सेल शीट से 3 डी रॉड जैसी संरचना बनाने के लिए एक 3-चरण (विस्तार, उत्तेजना और परिपक्वता) ऑर्गेनॉइड मॉडल स्थापित किया है, जो अपने स्वयं के ईसीएम, ऑटोक्राइन और पैराक्राइन कारकों के साथ एक प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है। इन रॉड जैसे ऑर्गेनोइड में समृद्ध ईसीएम के भीतर एक बहुस्तरीय सेलुलर आर्किटेक्चर होता है और स्थैतिक यांत्रिक तनाव के संपर्क में आने के लिए इसे आसानी से संभाला जा सकता है। यहां, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके 3-चरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। हम दिखा सकते हैं कि यह सेल प्रकार मजबूत और ईसीएम-प्रचुर मात्रा में ऑर्गेनोइड बनाता है। वर्णित प्रक्रिया को संस्कृति मीडिया के संदर्भ में आगे अनुकूलित किया जा सकता है और गतिशील अक्षीय यांत्रिक उत्तेजना की ओर अनुकूलित किया जा सकता है। उसी तरह, वैकल्पिक सेल स्रोतों को टी/एल ऑर्गेनोइड बनाने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है और इस प्रकार टी/एल भेदभाव से गुजरना पड़ता है। संक्षेप में, स्थापित 3 डी टी / एल ऑर्गेनॉइड दृष्टिकोण का उपयोग कण्डरा बुनियादी अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में और यहां तक कि मचान मुक्त टी / एल इंजीनियरिंग के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
टेंडन और लिगामेंट्स (टी/एल) मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम के महत्वपूर्ण घटक हैं जो शरीर को आवश्यक सहायता और स्थिरता प्रदान करते हैं। उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, इन संयोजी ऊतकों को अध: पतन और चोट लगने का खतरा होता है, जिससे दर्द और गतिशीलता की हानिहोती है। इसके अलावा, उनकी सीमित रक्त आपूर्ति और धीमी गति से उपचार क्षमता पुरानी चोटों को जन्म दे सकती है, जबकि उम्र बढ़ने, दोहराव की गति और अनुचित पुनर्वास जैसे कारक अध: पतन और चोट के जोखिम को और बढ़ातेहैं। पारंपरिक उपचार, जैसे आराम, भौतिक चिकित्सा और सर्जिकल हस्तक्षेप, टी / एल संरचना और कार्य को पूरी तरह से बहाल करने में असमर्थ हैं। पिछले कुछ वर्षों में, शोधकर्ताओं ने टी/एल विकारों 3,4,5के लिए प्रभावी उपचार की तलाश करने के लिए टी/एल की जटिल प्रकृति को बेहतर ढंग से समझने का प्रयास किया है। टी / एल एक पदानुक्रमित रूप से संगठित, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -वर्चस्व वाली संरचना द्वारा प्रतिष्ठित हैं, जो मुख्य रूप से टाइप I कोलेजन फाइबर और प्रोटीओग्लाइकेन्स से बना है, एक ऐसी विशेषता जिसे इन विट्रो6 में दोहराया जाना मुश्किल है। पारंपरिक द्वि-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति मॉडल टी / एल ऊतकों की विशेषता त्रि-आयामी (3 डी) संगठन को पकड़ने में विफल रहते हैं, उनकी अनुवाद क्षमता को सीमित करने के साथ-साथ टी / एल उत्थान के क्षेत्र में अभिनव प्रगति में बाधा डालते हैं।
हाल ही में, 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल के विकास ने 7,8,9,10,11,12,13 प्रकार के बुनियादी अनुसंधान और मचान मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाने के लिए नई संभावनाओं की पेशकश की है। उदाहरण के लिए, मायोटेंडिनस जंक्शन की जांच करने के लिए, लार्किन एट अल 2006 ने चूहे की पूंछकण्डरा 10 से प्राप्त स्व-संगठित कण्डरा खंडों के साथ मिलकर 3 डी कंकाल की मांसपेशी का निर्माण विकसित किया। इसके अलावा, Schiele एट अल 2013, micromachined फाइब्रोनेक्टिन लेपित विकास चैनलों का उपयोग करके, 3 डी मचान की सहायता के बिना सेलुलर फाइबर बनाने के लिए मानव त्वचीय fibroblasts की आत्म विधानसभा निर्देशित, एक दृष्टिकोण है कि भ्रूण कण्डरा विकास11 के प्रमुख लक्षण पकड़ सकते हैं. फ्लोरिडा एट अल 2016 द्वारा अध्ययन में, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं को पहले हड्डी और लिगामेंट वंशावली में विस्तारित किया गया था, अगले स्व-इकट्ठे मोनोलेयर सेल शीट उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता था, जिसे तब देशी पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट की नकल करते हुए एक मल्टीफैसिक हड्डी-लिगामेंट-हड्डी निर्माण बनाने के लिए लागू किया गया था, एक मॉडल जिसका लक्ष्य लिगामेंट पुनर्जनन12 की बेहतर समझ है. कण्डरा मेकेनोट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए, मुब्याना एट अल 2018 ने एक मचान मुक्त पद्धति का उपयोग किया जिसके द्वारा एकल कण्डरा फाइबर बनाए गए और यांत्रिक लोडिंग प्रोटोकॉल13 के अधीन थे। ऑर्गेनोइड स्व-संगठित 3 डी संरचनाएं हैं जो मूल वास्तुकला, माइक्रोएन्वायरमेंट और ऊतकों की कार्यक्षमता की नकल करती हैं। 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां ऊतक और अंग जीव विज्ञान के साथ-साथ पैथोफिज़ियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करती हैं। इस तरह के मॉडल भी विभिन्न स्टेम / पूर्वज सेल प्रकार14,15 के ऊतक विशिष्ट भेदभाव प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, टी/एल जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल को लागू करना एक बहुत ही आकर्षक दृष्टिकोण 9,16 बन जाता है। वैकल्पिक सेल स्रोतों को ऑर्गेनॉइड असेंबली के लिए लागू किया जा सकता है और टेनोजेनिक भेदभाव की ओर प्रेरित किया जा सकता है। इस अध्ययन में प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया एक प्रासंगिक सेल प्रकार त्वचीय fibroblasts 7,17,18 है. ये कोशिकाएं त्वचा बायोप्सी प्रक्रिया के माध्यम से आसानी से सुलभ होती हैं, जो अस्थि मज्जा पंचर या लिपोसक्शन की तुलना में कम आक्रामक होती है और उनकी अच्छी प्रोलिफेरेटिव क्षमता के कारण बड़ी संख्या में काफी जल्दी गुणा किया जा सकता है। इसके विपरीत, अधिक विशिष्ट सेल प्रकार, जैसे कि टी/एल-निवासी फाइब्रोब्लास्ट्स, को अलग करना और विस्तार करना अधिक चुनौतीपूर्ण होता है। इसलिए, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स भी प्रेरित प्लुरिपोटेंट भ्रूण स्टेम कोशिकाओं19 की ओर सेल रिप्रोग्रामिंग प्रौद्योगिकियों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया. विशिष्ट 3 डी संस्कृति की स्थिति और सिग्नलिंग संकेतों के लिए त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के अधीन, जैसे कि विकास कारक-बीटा 3 (टीजीएफ ß 3) को बदलना, जिसे विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करने के लिए सूचित किया गया है, जिसमें गठन और रखरखाव शामिल है टी/एल, उनके इन विट्रो टेनोजेनिक भेदभाव को शक्तिशाली बना सकता है जिससे कण्डरा-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति और टी/एल-विशिष्ट ईसीएम20 का जमाव होता है, 21.
यहां, हम सेल स्रोत के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामान्य वयस्क मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स (एनएचडीएफ) का उपयोग करके पहले से स्थापित और कार्यान्वित 3-चरण (2 डी विस्तार, 2 डी उत्तेजना, और 3 डी परिपक्वता) ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, जो अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल पेश करता है इन विट्रो टेनोजेनेसिस7. इस तथ्य के बावजूद कि यह मॉडल विवो टी / एल ऊतक के बराबर नहीं है, यह अभी भी एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणाली प्रदान करता है जिसका उपयोग सेलुलर भेदभाव तंत्र की जांच करने, इन विट्रो में टी / एल पैथोफिज़ियोलॉजी की नकल करने और टी / एल व्यक्तिगत दवा और दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों की स्थापना के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, भविष्य में, अध्ययन यह मूल्यांकन कर सकते हैं कि क्या 3 डी ऑर्गेनोइड मचान मुक्त टी / एल इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त हैं और साथ ही स्केल-अप यांत्रिक रूप से मजबूत निर्माणों के विकास के लिए उपयोग करने योग्य हैं जो देशी टी / एल ऊतकों के आयामों और संरचनात्मक और बायोफिजिकल गुणों से निकटता से मिलते जुलते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में प्रदर्शित परिणाम टी/एल ऊतकों के अध्ययन के लिए एनएचडीएफ 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल की स्थापना और लक्षण वर्णन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। 3-चरण प्रोटोकॉल ने 3 डी रॉड जैसे ऑर्गेनोइड के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डी.डी. और एस.एम.-डी. BMBF ग्रांट को स्वीकार करें “CellWiTaL: ड्रग रिसर्च के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल सिस्टम – त्रि-आयामी सेलुलर संरचनाओं में अत्यधिक विशिष्ट एकल कोशिकाओं की परत-मुक्त लेजर प्रिंटिंग को स्थानांतरित करें” प्रस्ताव Nr. 13N15874। डीडी और वीआरए यूरोपीय संघ एमएससीए-सीओफंड ग्रांट ओएसटीएस्किल्स को स्वीकार करते हैं, “अगली पीढ़ी के ऑस्टियोआर्थराइटिस शोधों का समग्र प्रशिक्षण,” जीए, एनआर 101034412। सभी लेखक तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती बीट गेयर को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
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