Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연
Summary
여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.
Abstract
힘줄과 인대(T/L)는 근골격계를 하나로 묶는 강력하고 계층적으로 조직된 구조입니다. 이 조직에는 주로 평행한 줄에 위치한 콜라겐 유형 I-rich 세포외 기질(ECM)과 T/L-계통 세포가 엄격하게 배열되어 있습니다. 부상 후 T/L은 고장 위험이 높고 종종 만족스럽지 않은 수리 결과로 재활에 오랜 시간이 필요합니다. 최근 T/L 생물학 연구의 발전에도 불구하고 남아 있는 과제 중 하나는 T/L 분야에는 여전히 체외에서 T/L 형성 과정을 재현할 수 있는 표준화된 분화 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포의 뼈 및 지방 분화에는 표준 2차원(2D) 세포 배양과 특정 자극 매체의 추가만 필요합니다. 연골을 분화하기 위해서는 3차원(3D) 펠릿 배양 및 TGFß 보충이 필요합니다. 그러나 힘줄에 대한 세포 분화에는 매우 질서 정연한 3D 배양 모델이 필요하며, 이상적으로는 동적 기계적 자극도 받을 수 있어야 합니다. 3-step (Expansion, Stimulation, and Maturation) 오가노이드 모델을 구축하여 자체 조립된 세포장에서 3D 막대 형태의 구조를 형성하였으며, 이를 통해 자체 ECM, 자가분비, 측분비 인자를 가진 자연스러운 미세환경을 구현하였습니다. 이러한 막대 모양의 오가노이드는 풍부한 ECM 내에서 다층 세포 구조를 가지고 있으며 정전기적인 기계적 변형에 노출될 경우 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 여기에서는 시판되는 진피 섬유아세포를 사용하여 3단계 프로토콜을 시연했습니다. 우리는 이 세포 유형이 견고하고 ECM이 풍부한 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 설명된 절차는 배양 배지 측면에서 더욱 최적화될 수 있고 동적 축방향 기계적 자극에 대해 최적화될 수 있습니다. 같은 방식으로, 대체 세포 소스가 T/L 오가노이드를 형성할 수 있는 잠재력을 테스트하여 T/L 분화를 거칠 수 있습니다. 요컨대, 확립된 3D T/L 오가노이드 접근 방식은 힘줄 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 모델로 사용할 수 있습니다.
Introduction
힘줄과 인대(T/L)는 신체에 필수적인 지지와 안정성을 제공하는 근골격계의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 결합 조직은 중요한 역할에도 불구하고 퇴화와 손상이 발생하기 쉬워 통증과 이동성 장애를 유발합니다1. 더욱이, 제한된 혈액 공급과 느린 치유 능력은 만성 부상으로 이어질 수 있으며, 노화, 반복적인 움직임 및 부적절한 재활과 같은 요인은 퇴행 및 부상의 위험을 더욱 증가시킨다2. 휴식, 물리치료, 외과적 치료와 같은 기존의 치료법으로는 T/L 구조와 기능을 완전히 회복할 수 없습니다. 지난 몇 년 동안 연구자들은 T/L 장애에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 T/L의 복잡한 특성을 더 잘 이해하기 위해 노력해 왔습니다 3,4,5. T/L은 주로 I형 콜라겐 섬유와 프로테오글리칸으로 구성된 계층적으로 조직화된 세포외 기질(ECM) 지배 구조로 구별되며, 이러한 특징은 시험관 내에서 복제하기 어려운 특징입니다 6. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 모델은 T/L 조직의 특징적인 3차원(3D) 조직을 포착하지 못하여 번역 잠재력을 제한하고 T/L 재생 분야의 혁신적인 발전을 저해합니다.
최근 3D 오가노이드 모델의 개발은 다양한 조직 유형 7,8,9,10,11,12,13의 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 조직 공학을 발전시킬 수 있는 새로운 가능성을 제공했습니다. 예를 들어, 근건성 접합부를 조사하기 위해 Larkin et al. 2006은 쥐 꼬리 힘줄10에서 파생된 자체 조직화된 힘줄 분절과 함께 3D 골격근 구조를 개발했습니다. 또한, Schiele et al. 2013은 미세 가공된 피브로넥틴 코팅 성장 채널을 사용하여 배아 힘줄 발달의 주요 특성을 포착할 수 있는 접근 방식인 3D 스캐폴드의 도움 없이 인간 피부 섬유아세포의 자가 조립을 지시하여 세포 섬유를 형성하도록 지시했습니다11. Florida et al. 2016의 연구에 따르면, 골수 기질 세포는 먼저 뼈 및 인대 계통으로 확장되었고, 그 다음에는 자가 조립 단층 세포 시트를 생성하는 데 사용되었으며, 그런 다음 인대 재생에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 모델인 천연 전방 십자인대를 모방한 다상 뼈-인대-뼈 구조를 만들기 위해 구현되었습니다12. 힘줄 기계전달 과정을 설명하기 위해 Mubyana et al. 2018은 단일 힘줄 섬유를 생성하고 기계적 하중 프로토콜13을 적용하는 스캐폴드가 없는 방법론을 활용했습니다. 오가노이드는 조직의 기본 아키텍처, 미세환경 및 기능을 모방하는 자체 조직화된 3D 구조입니다. 3D 오가노이드 배양은 조직 및 장기 생물학과 병태생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 모델을 제공합니다. 이러한 모델은 또한 상이한 줄기/전구 세포 유형의 조직 특이적 분화를 유도하는 데 사용될 수있다 14,15. 따라서 T/L 생물학 및 조직 공학 분야에서 3D 오가노이드 모델을 구현하는 것은 매우 매력적인 접근 방식이 됩니다 9,16. 대체 세포 소스는 오가노이드 어셈블리를 위해 구현될 수 있으며 tenogenic differentiation을 향해 자극될 수 있습니다. 이 연구에서 시연에 사용된 한 가지 관련 세포 유형은 피부 섬유아세포 7,17,18입니다. 이 세포는 피부 생검 절차를 통해 쉽게 접근할 수 있으며, 이는 골수 천자나 지방 흡입에 비해 덜 침습적이며 우수한 증식 능력으로 인해 상당히 빠르게 증식할 수 있습니다. 반면, T/L-상주 섬유아세포와 같은 보다 전문화된 세포 유형은 분리 및 확장이 더 까다롭습니다. 따라서, 피부 섬유아세포는 유도만능배아줄기세포(induced pluripotent embryonic stem cells)를 향한 세포 재프로그래밍 기술의 출발점으로도 사용되었다19. T/L의 형성 및 유지를 포함한 다양한 세포 과정의 핵심 조절자 역할을 하는 것으로 보고된 형질전환 성장 인자-베타 3(TGFß3)와 같은 특정 3D 배양 조건 및 신호 전달 신호에 피부 섬유아세포를 적용하면 힘줄 특이적 유전자의 발현 및 T/L-전형적인 ECM의 침착으로 이어지는 시험관 내 테노겐 분화를 강화할 수 있습니다.20, 21.
여기에서는 상업적으로 이용 가능한 정상적인 성인 인간 피부 섬유아세포(NHDF)를 세포 소스로 사용하여 이전에 확립 및 구현된 3단계(2D 확장, 2D 자극 및 3D 성숙) 오가노이드 프로토콜을 설명하고 시연하여 체외 건형성7을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 모델이 in vivo T/L 조직과 동일하지 않다는 사실에도 불구하고 세포 분화 메커니즘을 조사하고, in vitro에서 T/L 병태생리학을 모방하고, T/L 맞춤형 의료 및 약물 스크리닝 플랫폼을 구축하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 더 관련성 있는 시스템을 제공합니다. 또한, 향후 연구를 통해 3D 오가노이드가 추가 최적화를 통해 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링에 적합한지, 그리고 천연 T/L 조직의 치수와 구조적 및 생물물리학적 특성을 밀접하게 유사한 기계적으로 견고한 구조 개발에 활용할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 입증된 결과는 T/L 조직 연구를 위한 NHDF 3D 오가노이드 모델의 확립 및 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 3단계 프로토콜은 T/L 틈새의 전형적인 특징을 나타내는 3D 막대 모양의 오가노이드를 형성했습니다. 이 모델은 이전에 Kroner-Weigl et al. 20237 에 보고되었으며 여기에서 매우 자세히 시연되었습니다.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. 및 S.M.-D. BMBF Grant “CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research – transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures” 제안 번호 13N15874를 인정합니다. D.D.와 V.R.A.는 EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches”, GA Nr. 101034412. 모든 저자는 기술 지원을 제공한 Mrs. Beate Geyer를 인정합니다.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
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