İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi
Summary
Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.
Abstract
Tendonlar ve bağlar (T/L), kas-iskelet sistemini birleştiren güçlü hiyerarşik olarak organize edilmiş yapılardır. Bu dokular, sıkı bir şekilde düzenlenmiş kollajen tip I açısından zengin hücre dışı matrise (ECM) ve esas olarak paralel sıralar halinde konumlandırılmış T / L soy hücrelerine sahiptir. Yaralanmadan sonra, T/L, yüksek başarısızlık riski ve genellikle tatmin edici olmayan onarım sonuçları ile rehabilitasyon için uzun bir süre gerektirir. T / L biyoloji araştırmalarındaki son gelişmelere rağmen, kalan zorluklardan biri, T / L alanının, T / L oluşum sürecini in vitro olarak özetleyebilen standart bir farklılaşma protokolünden yoksun olmasıdır. Örneğin, mezenkimal öncü hücrelerin kemik ve yağ farklılaşması, sadece standart iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve spesifik stimülasyon ortamının eklenmesini gerektirir. Kıkırdak farklılaşması için üç boyutlu (3D) pelet kültürü ve TGFß takviyesi gereklidir. Bununla birlikte, tendona hücre farklılaşması, ideal olarak dinamik mekanik stimülasyona da tabi olması gereken çok düzenli bir 3D kültür modeline ihtiyaç duyar. Kendi ECM, otokrin ve parakrin faktörlerine sahip doğal bir mikro ortam sağlayan, kendi kendine monte edilmiş bir hücre tabakasından 3D çubuk benzeri bir yapı oluşturmak için 3 adımlı (genişleme, stimülasyon ve olgunlaşma) bir organoid model oluşturduk. Bu çubuk benzeri organoidler, zengin ECM içinde çok katmanlı bir hücresel mimariye sahiptir ve statik mekanik gerilmeye maruz kalmak için oldukça kolay bir şekilde ele alınabilir. Burada, piyasada bulunan dermal fibroblastları kullanarak 3 aşamalı protokolü gösterdik. Bu hücre tipinin sağlam ve ECM açısından bol organoidler oluşturduğunu gösterebiliriz. Tarif edilen prosedür, kültür ortamı açısından daha da optimize edilebilir ve dinamik eksenel mekanik stimülasyona doğru optimize edilebilir. Aynı şekilde, alternatif hücre kaynakları, T/L organoidleri oluşturma potansiyelleri açısından test edilebilir ve böylece T/L farklılaşmasına uğrayabilir. Özetle, yerleşik 3D T / L organoid yaklaşımı, tendon temel araştırması ve hatta iskele içermeyen T / L mühendisliği için bir model olarak kullanılabilir.
Introduction
Tendonlar ve bağlar (T/L), vücuda temel destek ve stabilite sağlayan kas-iskelet sisteminin hayati bileşenleridir. Kritik rollerine rağmen, bu bağ dokuları dejenerasyona ve yaralanmaya eğilimlidir, bu da ağrıya ve hareketliliğin bozulmasına neden olur1. Ayrıca, sınırlı kan temini ve yavaş iyileşme kapasitesi kronik yaralanmalara yol açabilirken, yaşlanma, tekrarlayan hareketler ve yanlış rehabilitasyon gibi faktörler dejenerasyon ve yaralanma riskini daha da artırır2. Dinlenme, fizik tedavi ve cerrahi müdahaleler gibi geleneksel tedaviler, T / L yapısını ve işlevini tam olarak eski haline getiremez. Son birkaç yılda, araştırmacılar T / L bozuklukları için etkili tedaviler aramak için T / L’nin karmaşık doğasını daha iyi anlamaya çalıştılar 3,4,5. T / L, esas olarak tip I kollajen lifleri ve proteoglikanlardan oluşan, hiyerarşik olarak organize, hücre dışı matris (ECM) baskın bir yapı ile ayırt edilir, bu da in vitro6’da kopyalanması zor bir özelliktir. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü modelleri, T/L dokularının karakteristik üç boyutlu (3D) organizasyonunu yakalayamamakta, bu da translasyon potansiyellerini sınırlamakta ve T/L rejenerasyonu alanındaki yenilikçi ilerlemeyi engellemektedir.
Son zamanlarda, 3D organoid modellerin geliştirilmesi, çeşitli doku tiplerinin temel araştırmalarını ve iskelesiz doku mühendisliğini ilerletmek için yeni olanaklar sunmuştur7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, miyotendinöz bileşkeyi araştırmak için, Larkin ve ark. 2006, sıçan kuyruğu tendonu10’dan türetilen kendi kendini organize eden tendon segmentleri ile birlikte 3D iskelet kası yapıları geliştirdi. Ayrıca, Schiele ve ark. 2013, mikro işlenmiş fibronektin kaplı büyüme kanallarını kullanarak, embriyonik tendon gelişiminin temel özelliklerini yakalayabilen bir yaklaşım olan 3D iskele yardımı olmadan hücresel lifler oluşturmak için insan dermal fibroblastlarının kendi kendine montajını yönlendirdi11. Florida ve ark. 2016 tarafından yapılan çalışmada, kemik iliği stromal hücreleri önce kemik ve bağ soylarına genişletildi, daha sonra kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı hücre tabakaları oluşturmak için kullanıldı, bunlar daha sonra doğal ön çapraz bağı taklit eden çok fazlı bir kemik-bağ-kemik yapısı oluşturmak için uygulandı, bağ rejenerasyonunun daha iyi anlaşılmasını amaçlayan bir model12. Tendon mekanotransdüksiyon süreçlerini aydınlatmak için Mubyana ve ark. 2018, tek tendon liflerinin oluşturulduğu ve mekanik yükleme protokolüne tabi tutulduğu iskelesiz bir metodoloji kullandı13. Organoidler, dokuların doğal mimarisini, mikro çevresini ve işlevselliğini taklit eden, kendi kendini organize eden 3B yapılardır. 3D organoid kültürler, doku ve organ biyolojisinin yanı sıra patofizyolojiyi incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir model sağlar. Bu tür modeller, farklı kök/progenitör hücre tiplerinindokuya özgü farklılaşmasını indüklemek için de kullanılabilir 14,15. Bu nedenle, T/L biyolojisi ve doku mühendisliği alanında 3D organoid modellerin uygulanması çok çekici bir yaklaşım haline gelmektedir 9,16. Organoid montajı için alternatif hücre kaynakları uygulanabilir ve tenojenik farklılaşmaya doğru uyarılabilir. Bu çalışmada gösterim için kullanılan ilgili bir hücre tipi dermal fibroblastlar 7,17,18’dir. Bu hücrelere, kemik iliği ponksiyonu veya liposuction ile karşılaştırıldığında daha az invaziv olan ve iyi proliferatif kapasiteleri nedeniyle oldukça hızlı bir şekilde büyük sayılara çarpılabilen bir cilt biyopsisi prosedürü ile kolayca erişilebilir. Buna karşılık, T / L’de yerleşik fibroblastlar gibi daha özel hücre tiplerinin izole edilmesi ve genişletilmesi daha zordur. Bu nedenle, dermal fibroblastlar, indüklenmiş pluripotent embriyonik kök hücrelere yönelik hücre yeniden programlama teknolojileri için bir başlangıç noktası olarak da kullanılmıştır19. Dermal fibroblastların, T/L’nin oluşumu ve sürdürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerin anahtar bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği bildirilen transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGFß3) gibi spesifik 3D kültür koşullarına ve sinyal ipuçlarına tabi tutulması, tendona özgü genlerin ekspresyonuna ve T/L-tipik ECM20’nin birikmesine yol açan in vitro tenojenik farklılaşmalarını güçlendirebilir, 21.
Burada, hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal yetişkin insan dermal fibroblastlarını (NHDF’ler) kullanarak önceden kurulmuş ve uygulanmış 3 aşamalı (2D genişleme, 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma) organoid protokolünü tanımlıyor ve gösteriyoruz ve in vitro tenogenez7. Bu model in vivo T/L dokusuna eşdeğer olmamasına rağmen, hücresel farklılaşma mekanizmalarını araştırmak, in vitro T/L patofizyolojisini taklit etmek ve T/L kişiselleştirilmiş tıp ve ilaç tarama platformları oluşturmak için kullanılabilecek fizyolojik olarak daha ilgili bir sistem sunmaktadır. Ayrıca, gelecekte, çalışmalar, 3D organoidlerin iskelesiz T/L mühendisliği için uygun olup olmadığını, daha fazla optimizasyon ile değerlendirebilir ve aynı zamanda doğal T/L dokularının boyutlarına ve yapısal ve biyofiziksel özelliklerine çok benzeyen ölçeklendirilmiş mekanik olarak sağlam yapıların geliştirilmesi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada gösterilen sonuçlar, T / L dokularını incelemek için NHDF 3D organoid modelinin kurulması ve karakterizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar. 3 aşamalı protokol, T / L nişinin tipik özelliklerini sergileyen 3D çubuk benzeri organoidlerin oluşumuna yol açtı. Bu model daha önce Kroner-Weigl ve ark. 20237 ve burada çok ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
Şekil 2’de sunulan faz kontrast görünt?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. ve S.M.-D. BMBF Hibesi “CellWiTaL: İlaç araştırmaları için tekrarlanabilir hücre sistemleri – üç boyutlu hücresel yapılarda son derece spesifik tek hücrelerin transfer katmansız lazer baskısı” Teklif Nr. 13N15874’ü kabul edin. D.D. ve V.R.A., AB MSCA-COFUND Hibesini kabul etti: OSTASKILLS “Yeni nesil Osteoartrit araştırmalarının bütünsel eğitimi”, GA Nr. 101034412. Tüm yazarlar teknik yardım için Bayan Beate Geyer’e teşekkür eder.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
