Här demonstrerar vi en organoidmodell i tre steg (tvådimensionell [2D] expansion, 2D-stimulering, tredimensionell [3D] mognad) som erbjuder ett lovande verktyg för grundforskning om senor och en potentiell ställningsfri metod för senvävnadsteknik.
Senor och ligament (T/L) är starka, hierarkiskt organiserade strukturer som förenar det muskuloskeletala systemet. Dessa vävnader har en strikt ordnad kollagen typ I-rik extracellulär matris (ECM) och T/L-linjeceller huvudsakligen placerade i parallella rader. Efter skada kräver T/L lång tid för rehabilitering med hög risk för fel och ofta otillfredsställande reparationsresultat. Trots de senaste framstegen inom T/L-biologisk forskning är en av de återstående utmaningarna att T/L-fältet fortfarande saknar ett standardiserat differentieringsprotokoll som kan rekapitulera T/L-bildningsprocessen in vitro. Till exempel kräver ben- och fettdifferentiering av mesenkymala prekursorceller endast vanlig tvådimensionell (2D) cellodling och tillsats av specifika stimuleringsmedier. För differentiering till brosk är tredimensionell (3D) pelletsodling och tillskott av TGFß nödvändig. Celldifferentiering till sena kräver dock en mycket ordnad 3D-odlingsmodell, som i idealfallet också bör vara föremål för dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etablerat en 3-stegs (expansion, stimulering och mognad) organoidmodell för att bilda en 3D-stavliknande struktur av ett självmonterat cellark, vilket ger en naturlig mikromiljö med sina egna ECM, autokrina och parakrina faktorer. Dessa stavliknande organoider har en flerskiktad cellulär arkitektur inom rik ECM och kan hanteras ganska enkelt för exponering för statisk mekanisk belastning. Här demonstrerade vi 3-stegsprotokollet genom att använda kommersiellt tillgängliga dermala fibroblaster. Vi kunde visa att denna celltyp bildar robusta och ECM-rikliga organoider. Den beskrivna proceduren kan optimeras ytterligare när det gäller odlingsmedia och optimeras mot dynamisk axiell mekanisk stimulering. På samma sätt kan alternativa cellkällor testas för deras potential att bilda T/L-organoider och därmed genomgå T/L-differentiering. Sammanfattningsvis kan den etablerade 3D T/L-organoidmetoden användas som en modell för grundforskning om senor och till och med för ställningsfri T/L-teknik.
Senor och ligament (T/L) är viktiga komponenter i muskuloskeletala systemet som ger viktigt stöd och stabilitet till kroppen. Trots sin avgörande roll är dessa bindväv benägna att degeneration och skadas, vilket orsakar smärta och försämring av rörligheten1. Dessutom kan deras begränsade blodtillförsel och långsamma läkningsförmåga leda till kroniska skador, medan faktorer som åldrande, repetitiva rörelser och felaktig rehabilitering ytterligare ökar risken för degeneration och skada2. Konventionella behandlingar, såsom vila, sjukgymnastik och kirurgiska ingrepp, kan inte helt återställa T/L-strukturen och funktionen. Under de senaste åren har forskare strävat efter att bättre förstå den intrikata karaktären hos T/L för att kunna söka effektiva behandlingar för T/L-störningar 3,4,5. T/L kännetecknas av en hierarkiskt organiserad, extracellulär matris (ECM)-dominerad struktur, som främst består av kollagenfibrer av typ I och proteoglykaner, en egenskap som är svår att replikera in vitro6. Traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmodeller misslyckas med att fånga den karakteristiska tredimensionella (3D) organisationen av T/L-vävnader, vilket begränsar deras translationella potential samt hindrar innovativa framsteg inom området T/L-regenerering.
På senare tid har utvecklingen av 3D-organoidmodeller erbjudit nya möjligheter för att främja grundforskning och ställningsfri vävnadsteknik för olika vävnadstyper 7,8,9,10,11,12,13. Till exempel, för att undersöka myotendinous junction, utvecklade Larkin et al. 2006 3D-skelettmuskelkonstruktioner tillsammans med självorganiserade sensegment som härrör från råttsvanssena10. Dessutom riktade Schiele et al. 2013, genom att använda mikrobearbetade fibronektinbelagda tillväxtkanaler, självorganiseringen av humana dermala fibroblaster för att bilda cellulära fibrer utan hjälp av 3D-ställning, ett tillvägagångssätt som kan fånga viktiga egenskaper hos embryonal senutveckling11. I studien av Florida et al. 2016 utvidgades benmärgsstromaceller först till ben- och ligamentlinjer, därefter användes de för att generera självmonterade monolagercellark, som sedan implementerades för att skapa en multifasisk ben-ligament-benkonstruktion som efterliknar det ursprungliga främre korsbandet, en modell som syftar till förbättrad förståelse av ligamentregenerering12. För att belysa senmekanotransduktionsprocesser använde Mubyana et al. 2018 en ställningsfri metodik genom vilken enstaka senfibrer skapades och utsattes för mekanisk belastningsprotokoll13. Organoider är självorganiserade 3D-strukturer som efterliknar den ursprungliga arkitekturen, mikromiljön och funktionaliteten hos vävnader. 3D-organoidkulturer ger en mer fysiologiskt relevant modell för att studera vävnads- och organbiologi samt patofysiologi. Sådana modeller kan också användas för att inducera vävnadsspecifik differentiering av olika stam-/stamcellstyper14,15. Att implementera 3D-organoidmodeller inom T/L-biologi och vävnadsteknik blir därför ett mycket attraktivt tillvägagångssätt 9,16. Alternativa cellkällor kan implementeras för organoidsammansättningen och stimuleras mot tenogen differentiering. En relevant celltyp som används för demonstration i denna studie är dermala fibroblaster 7,17,18. Dessa celler är lättillgängliga genom en hudbiopsiprocedur, som är mindre invasiv jämfört med benmärgspunktion eller fettsugning och kan föröka sig ganska snabbt till ett stort antal på grund av deras goda proliferativa kapacitet. Däremot är mer specialiserade celltyper, såsom T/L-residenta fibroblaster, mer utmanande att isolera och expandera. Därför användes dermala fibroblaster också som en utgångspunkt för cellomprogrammeringstekniker mot inducerade pluripotenta embryonala stamceller19. Genom att utsätta dermala fibroblaster för specifika 3D-odlingsförhållanden och signalsignaler, såsom transforming growth factor-beta 3 (TGFß3), som har rapporterats fungera som en nyckelregulator för olika cellulära processer, inklusive bildning och underhåll av T/L, kan deras tenogena differentiering in vitro som leder till uttryck av senspecifika gener och deponering av T/L-typisk ECM20. 21. veckor
Här beskriver och demonstrerar vi ett tidigare etablerat och implementerat 3-stegs (2D-expansion, 2D-stimulering och 3D-mognad) organoidprotokoll med hjälp av kommersiellt tillgängliga normala vuxna humana dermala fibroblaster (NHDF) som cellkälla, vilket erbjuder en värdefull modell för att studera in vitro tenogenes7. Trots det faktum att denna modell inte är ekvivalent med in vivo T/L-vävnad, ger den fortfarande ett mer fysiologiskt relevant system som kan användas för att undersöka cellulära differentieringsmekanismer, efterlikna T/L-patofysiologi in vitro och etablera T/L-anpassade medicin- och läkemedelsscreeningplattformar. Dessutom kan studier i framtiden utvärdera om 3D-organoiderna är lämpliga för ställningsfri T/L-teknik genom ytterligare optimering samt kan användas för utveckling av uppskalade mekaniskt robusta konstruktioner som liknar dimensionerna och strukturella och biofysiska egenskaperna hos nativa T/L-vävnader.
Resultaten som visas i denna studie ger värdefulla insikter i etableringen och karakteriseringen av NHDF 3D-organoidmodellen för studier av T/L-vävnader. 3-stegsprotokollet ledde till bildandet av 3D-stavliknande organoider som uppvisar typiska egenskaper hos T/L-nischen. Denna modell har tidigare rapporterats i Kroner-Weigl et al. 20237 och demonstreras i detalj här.
Faskontrastbilderna som presenterades i figur 2 visade progr…
The authors have nothing to disclose.
D.D. och S.M.-D. erkänn BMBF-bidraget “CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research – transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures” Proposal Nr. 13N15874. D.D. och V.R.A. erkänner EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistisk utbildning av nästa generations artrosforskare” GA Nr. 101034412. Alla författare tackar Mrs. Beate Geyer för teknisk hjälp.
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |