Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Patiënt-afgeleide organoïde (PDO) modellen van kanker zijn een multifunctioneel onderzoekssysteem dat menselijke ziekten beter recapituleert in vergelijking met kankercellijnen. PDO-modellen kunnen worden gegenereerd door tumorcellen van patiënten te kweken in extracellulaire basale membraanextracten (BME) en deze te plateren als driedimensionale koepels. In de handel verkrijgbare reagentia die zijn geoptimaliseerd voor fenotypische tests in monolaagculturen zijn echter vaak niet compatibel met BME. Hierin beschrijven we een methode om PDO-modellen in kaart te brengen en de effecten van geneesmiddelen te beoordelen met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem met levende cellen. Daarnaast passen we fluorescerende kleurstoffen toe die compatibel zijn met kinetische metingen om de celgezondheid en apoptose tegelijkertijd te kwantificeren. Het vastleggen van afbeeldingen kan worden aangepast om met regelmatige tussenpozen gedurende meerdere dagen plaats te vinden. Gebruikers kunnen de effecten van geneesmiddelen analyseren in individuele Z-vlakbeelden of een Z-projectie van seriële beelden van meerdere brandpuntsvlakken. Met behulp van maskering worden specifieke parameters berekend die van belang zijn, zoals PDO-nummer, oppervlakte en fluorescentie-intensiteit. We leveren proof-of-concept-gegevens die het effect van cytotoxische middelen op celgezondheid, apoptose en levensvatbaarheid aantonen. Dit geautomatiseerde kinetische beeldvormingsplatform kan worden uitgebreid naar andere fenotypische uitlezingen om inzicht te krijgen in diverse therapeutische effecten in PDO-modellen van kanker.
Inleiding
Patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's) zijn snel in opkomst als een robuust modelsysteem om de ontwikkeling van kanker en therapeutische reacties te bestuderen. BOB's zijn driedimensionale (3D) celkweeksystemen die het complexe genomische profiel en de architectuur van de primaire tumor samenvatten 1,2. In tegenstelling tot traditionele tweedimensionale (2D) culturen van onsterfelijke kankercellijnen, vangen BOB's intratumorale heterogeniteitop en behouden deze 3,4, waardoor ze een waardevol hulpmiddel zijn voor zowel mechanistisch als translationee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Studies met menselijke tumormonsters werden beoordeeld en goedgekeurd door de University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protocol #201809807, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die aan het onderzoek deelnamen. Inclusiecriteria zijn onder meer een diagnose van kanker en de beschikbaarheid van tumormonsters.
1. Intacte BOB's plateren in een plaat met 96 putjes
- Bereid reagentia voor.
- Verwarm de platen met 96 putjes een nacht voor ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ons doel was om de haalbaarheid aan te tonen van het gebruik van gemultiplexte beeldvorming van levende cellen om de therapeutische respons van PDO's te beoordelen. Proof of concept-experimenten werden uitgevoerd in twee afzonderlijke BOB-modellen van endometriumkanker: ONC-10817 en ONC-10811 (zie aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor ONC-10811-gegevens). Apoptose (annexine V-kleuring) en cytotoxiciteit (opname van Cytotox Green) werden kinetisch gecontroleerd als reactie op .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
PDO-culturen worden een steeds populairder in vitro modelsysteem vanwege hun vermogen om cellulaire reacties en gedragingen weer te geven. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van het genereren, kweken en uitbreiden van BOB's, maar de methoden om therapeutische reacties te analyseren zijn achtergebleven. In de handel verkrijgbare 3D-levensvatbaarheidskits zijn lytische eindpuntassays, die potentieel waardevolle kinetische responsgegevens missen en daaropvolgende analyses met andere.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
KWT is mede-eigenaar van Immortagen Inc. CJD is een werknemer van Agilent. JSdB heeft zitting gehad in adviesraden en vergoedingen ontvangen van Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo en Vertex Pharmaceuticals; is een werknemer van het Institute of Cancer Research (ICR), die voor zijn onderzoekswerk financiering of andere steun heeft ontvangen van AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer en Vertex, en die een commercieel belang heeft in abirateron, PARP-remming bij DNA-reparatie defecte kankers, en PI3K/AKT-routeremmers (geen persoonlijk inkomen); is genoemd als uitvinder, zonder financieel belang, voor octrooi 8 822 438, ingediend door Janssen dat betrekking heeft op het gebruik van abirateronacetaat met corticosteroïden; is de CI/PI geweest van veel door de industrie gesponsorde klinische onderzoeken; en is een senior onderzoeker van het National Institute for Health Research (NIHR). Er zijn geen andere auteurs die potentiële belangenconflicten openbaar moeten maken.
Dankbetuigingen
We zijn de Tissue Procurement Core en Dr. Kristen Coleman van de Universiteit van Iowa dankbaar voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten en Dr. Sofia Gabrilovich van de afdeling Verloskunde en Gynaecologie voor het helpen bij het genereren van PDO-modellen. We danken ook Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) voor haar kritische analyse van het manuscript. We erkennen de volgende financieringsbronnen: NIH/NCI CA263783 en DOD CDMRP CA220729P1 aan KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation en Medical Research Council aan JSdB. De financiers hadden geen rol in het ontwerp of de analyse van experimenten of de beslissing om te publice....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
| 96-well plate | Corning Costar | 3596 | Voorverwarmd tot 37 °C |
| 96-well plate | Agilent | 204626-100 | Voorverwarmd tot 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | De uiteindelijke concentratie is 500 nM (component van organoid kweekmedium) |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | Component van organoid kweekmedium |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | De uiteindelijke concentratie is 1x (component van organoid kweekmedium) |
| BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Incubator voor op tafel; BioSpa OnDemand planningssoftware communiceert met Gen5 om platen over te zetten tussen de BioSpa en de Cytation 5 voor beeldvorming (dit protocol gebruikt versie 1.01.10) |
| BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software wordt gebruikt voor dit apparaat (dit protocol gebruikt versie 3.12.08) |
| Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
| Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Geconstitueerd in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | De uiteindelijke concentratie is 10 µM (component van organoid kweekmedium) |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | De uiteindelijke concentratie is 1x (component van organoid kweekmedium) |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | De uiteindelijke concentratie is 10 mM (component van organoid kweekmedium) |
| Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | De uiteindelijke concentratie is 0.5 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | De uiteindelijke concentratie is 10 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | De uiteindelijke concentratie is 250 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | De uiteindelijke concentratie is 500 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
| Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
| Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Geconstitueerd in organoid kweekmedium |
| Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO oplossing |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | De uiteindelijke concentratie is 1.25 mM (component van organoid kweekmedium) |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Voeg 1:50 volume toe |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | De uiteindelijke concentratie is 10 mM (component van organoid kweekmedium) |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | De uiteindelijke concentratie is 100 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | De uiteindelijke concentratie is 10 eenheden/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | De uiteindelijke concentratie is 100 µg/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | De uiteindelijke concentratie is 37.5 ng/mL (component van organoid kweekmedium) |
| Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | De uiteindelijke concentratie is 5 µM (component van organoid kweekmedium) |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | De uiteindelijke concentratie is 100 nM (component van organoid kweekmedium) |
Referenties
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
- Sachs, N., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
