פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה חיונית ברשתית החיצונית האחראית לתמיכה בפוטורצפטורים. ניוון RPE מתרחש בדרך כלל במחלות המסומנות על ידי אובדן ראייה מתקדם, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). מחקר על AMD מסתמך לעתים קרובות על עיניים מתורם אנושי או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) כדי לייצג את RPE. עם זאת, מקורות RPE אלה דורשים תקופות בידול ממושכות ומומחיות משמעותית לטיפוח. בנוסף, לחלק ממוסדות המחקר, במיוחד אלה באזורים כפריים, אין גישה נוחה לעיני התורם. בעוד קו תאי RPE אימורטלי זמין מסחרית (ARPE-19) קיים, הוא חסר תכונות RPE חיוניות in vivo ואינו מקובל באופן נרחב בפרסומים מחקריים רבים בתחום רפואת העיניים. יש צורך דחוף להשיג תאי RPE ראשוניים מייצגים ממקור זמין וחסכוני יותר. פרוטוקול זה מבהיר את הבידוד ותת-התרבות של תאי RPE ראשוניים המתקבלים לאחר המוות מעיניים חזיריות, אשר ניתן להשיג באופן מקומי מספקים מסחריים או אקדמיים. פרוטוקול זה מחייב חומרים נפוצים הנמצאים בדרך כלל במעבדות לתרביות רקמה. התוצאה היא חלופה ראשונית, מובחנת וחסכונית לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), עיני תורם אנושי ותאי ARPE-19.
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי הממוקם ברשתית החיצונית בין קרום ברוך לבין הפוטורצפטורים1. תאי RPE יוצרים צמתים הדוקים עם חלבונים כגון zonula occludens-1 (ZO-1) ובעלי פנוטיפ ייחודי המאופיין בפיגמנטציה ומורפולוגיה משושה 2,3. תאים אלה תורמים למחסום הדם-רשתית, ובכך תומכים בבריאות קולטני האור ושומרים על הומאוסטזיס רשתית 4,5. בנוסף, תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בראייה על ידי קליטת אור ומיחזור רכיבים חיוניים עבור קולטני האור6. לדוגמה, RPE65, חלבון המתבטא היטב בתאי RPE, ממיר אסטרי רטיניל all-trans לרטינול 11-cis 7,8. בהתחשב במגוון התפקודים המבוצעים על ידי תאי RPE, חוסר התפקוד שלהם מעורב במחלות שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל ורטינופתיה סוכרתית 9,10. כדי לשפר את ההבנה של פתולוגיות רשתית ולפתח טיפולים חדשים, מודלים במבחנה של הרשתית משמשים לעתים קרובות.
כדי ליצור מודלים מייצגים של רשתיות בריאות או חולות, הכרחי להשתמש בסוג תא RPE מימטי. קו תאי ARPE-19 הזמין מסחרית חסר פנוטיפים מקוריים, כגון פיגמנטציה, בעוד iPSCs יכול לקחת חודשים כדי להבדיל 11,12,13. למרות שעיניים מתורם אנושי עשויות להיות אידיאליות, לעתים קרובות הן אינן זמינות למעבדות מחקר רבות.
כאן, פיתחנו שיטה לשימוש בעיניים חזיריות, החולקות קווי דמיון רבים עם עיניים אנושיות14, להשגת תאי RPE ראשוניים. תאי RPE חזיריים ראשוניים אלה שימשו במספר מודלים של רשתית15,16. לא רק שתאים אלה חסכוניים, הם גם דורשים פחות זמן לרכוש מאשר iPSCs או עיניים תורמות. בנוסף, הם מציגים מאפיינים מקומיים, כגון פיגמנטציה ומיקרוווילי. בעוד פרוטוקולים דומים למיצוי RPE חזירי קיימים 17,18,19, טכניקה פשוטה ומפורטת זו מאמתת עוד יותר דיסוציאציה אנזימטית ומשתמשת בחומרים הנפוצים ברוב מעבדות תרביות התא.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד תאי RPE מעיניים חזיריות. פיגמנטציה ומורפולוגיה מרוצפת נראים בתוך 7 ימים של בידוד (איור 1B). יתר על כן, נתוני TEER מצביעים על היווצרות צומת הדוקה22 וחד-שכבה בריאה (איור 5). תוצאות אלה מראות כי תאי RPE שבודדו בשיטה זו דומים ל-RPE אנ…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לפרהאד פרג’וד על העזרה בתרבית תאי RPE חזיריים ובידודם, ולתומאס האריס על העזרה עם SEM. המחברים מודים על התמיכה של מתקן הליבה מיקרוסקופיה באוניברסיטת מדינת יוטה לניתוח SEM. המתקן מחזיק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק שנרכש באמצעות מענק מכשור מחקר מרכזי של הקרן הלאומית למדע (CMMI-1337932). המימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק 1R15EY028732 (Vargis) ומענק קרן BrightFocus M2019109 (Vargis). מימון נוסף ניתן על ידי מענק מחקר והזדמנויות יצירתיות לתואר ראשון (Weatherston) ממשרד המחקר של אוניברסיטת מדינת יוטה ומענק זרע (Vargis) מהמרכז לחקר מחלת האלצהיימר והדמנציה של אוניברסיטת יוטה.
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
Biosafety Cabinet | |||
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
Centrifuge | |||
Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
Deionized Water | |||
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
Flashlight | |||
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
Ice | Crushed prefered | ||
Inverted Phase Contrast Microscope | |||
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
Vacuum Aspiration System | |||
Water Bath, 37 °C | |||
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |