इन विट्रो मॉडलिंग के लिए प्राथमिक पोर्सिन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल स्थानीय रूप से सोर्स किए गए पोर्सिन आंखों से प्राथमिक रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं को प्राप्त करने और संवर्धन करने की प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है। ये कोशिकाएं स्टेम कोशिकाओं के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले विकल्प के रूप में काम करती हैं और इन विट्रो रेटिना अनुसंधान के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) बाहरी रेटिना में एक महत्वपूर्ण मोनोलेयर है जो फोटोरिसेप्टर का समर्थन करने के लिए जिम्मेदार है। आरपीई अपघटन आमतौर पर प्रगतिशील दृष्टि हानि द्वारा चिह्नित बीमारियों में होता है, जैसे कि उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी)। एएमडी पर शोध अक्सर आरपीई का प्रतिनिधित्व करने के लिए मानव दाता आंखों या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) पर निर्भर करता है। हालांकि, इन आरपीई स्रोतों को संवर्धन के लिए विस्तारित भेदभाव अवधि और पर्याप्त विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कुछ शोध संस्थान, विशेष रूप से ग्रामीण क्षेत्रों में, दाता आंखों तक आसान पहुंच की कमी है। जबकि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमर आरपीई सेल लाइन (एआरपीई -19) मौजूद है, इसमें विवो आरपीई सुविधाओं में आवश्यक कमी है और कई नेत्र विज्ञान अनुसंधान प्रकाशनों में व्यापक रूप से स्वीकार नहीं किया जाता है। अधिक आसानी से उपलब्ध और लागत प्रभावी स्रोत से प्रतिनिधि प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने की एक दबाव की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल पोर्सिन आंखों से पोस्ट-मॉर्टम प्राप्त प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के अलगाव और उपसंस्कृति को स्पष्ट करता है, जिसे वाणिज्यिक या शैक्षणिक आपूर्तिकर्ताओं से स्थानीय रूप से प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल आम तौर पर ऊतक संस्कृति प्रयोगशालाओं में पाया आम सामग्री की आवश्यकता. परिणाम IPSC के लिए एक प्राथमिक, विभेदित, और लागत प्रभावी विकल्प है, मानव दाता आंखों, और ARPE-19 कोशिकाओं.
Introduction
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ब्रुच की झिल्ली और फोटोरिसेप्टर1 के बीच बाहरी रेटिना में स्थित एक मोनोलेयर है। आरपीई कोशिकाएं ज़ोनुला ऑक्लुडेंस -1 (ज़ो -1) जैसे प्रोटीन के साथ तंग जंक्शन बनाती हैं और रंजकता और हेक्सागोनल आकृति विज्ञान 2,3 द्वारा विशेषता एक विशिष्ट फेनोटाइप रखती हैं। ये कोशिकाएं रक्त-रेटिना बाधा में योगदान करती हैं, जिससे फोटोरिसेप्टर स्वास्थ्य का समर्थन होता है और रेटिना होमियोस्टेसिस 4,5 को बनाए रखता है। इसके अतिरिक्त, आरपीई कोशिकाएं प्रकाश को अवशोषित करके और फोटोरिसेप्टर 6 के लिए आवश्यक घटकों को रीसाइक्लिंग करके दृष्टि में महत्वपूर्ण भूमिका निभातीहैं। उदाहरण के लिए, RPE65, RPE कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त एक प्रोटीन, सभी ट्रांस रेटिनिल एस्टर को 11-सीआईएस रेटिनॉल 7,8 में परिवर्तित करता है। आरपीई कोशिकाओं द्वारा किए गए कार्यों की भीड़ को देखते हुए, उनकी शिथिलता विभिन्न रोगों में फंसी है, जिसमें उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन और मधुमेह रेटिनोपैथी 9,10 शामिल हैं। रेटिना विकृति की समझ को बढ़ाने और नए उपचार विकसित करने के लिए, रेटिना के इन विट्रो मॉडल में अक्सर नियोजित होते हैं।
स्वस्थ या रोगग्रस्त रेटिना के प्रतिनिधि मॉडल उत्पन्न करने के लिए, एक नकली आरपीई सेल प्रकार का उपयोग करना अनिवार्य है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एआरपीई -19 सेल लाइन में देशी फेनोटाइप का अभाव है, जैसे कि रंजकता, जबकि आईपीएससीको 11,12,13 में अंतर करने में महीनों लग सकते हैं। यद्यपि मानव दाता आंखें आदर्श हो सकती हैं, वे अक्सर कई शोध प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं होती हैं।
यहां, हमने प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पोर्सिन आंखों का उपयोग करने के लिए एक विधि तैयार की है, जो मानव आंखों14 के साथ कई समानताएं साझा करती है। इन प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं का उपयोग कई रेटिनामॉडल15,16में किया गया है। इतना ही नहीं इन कोशिकाओं लागत प्रभावी हैं, लेकिन वे भी IPSC या दाता आंखों की तुलना में प्राप्त करने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है. इसके अतिरिक्त, वे देशी विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, जैसे रंजकता और माइक्रोविली। जबकि पोर्सिन आरपीई निष्कर्षण के लिए समान प्रोटोकॉल 17,18,19मौजूद हैं, यह सीधी और विस्तृत तकनीक आगे एंजाइमी पृथक्करण को मान्य करती है और आमतौर पर अधिकांश सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं में पाई जाने वाली सामग्रियों को नियोजित करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल बताता है कि पोर्सिन आंखों से आरपीई कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। रंजकता और cobblestone आकृति विज्ञान अलगाव (चित्रा 1 बी) के 7 दिनों के भीतर देखा जाता है. इसके अलावा, टीईईआर डेटा तंग जंक्श?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पोर्सिन आरपीई सेल संस्कृति और अलगाव के साथ मदद के लिए फरहाद फरजूद और एसईएम के साथ मदद के लिए थॉमस हैरिस को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक एसईएम विश्लेषण के लिए यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा से समर्थन स्वीकार करते हैं। यह सुविधा एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट (सीएमएमआई -1337932) के माध्यम से प्राप्त एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को बनाए रखती है। इस अध्ययन के लिए वित्त पोषण अनुदान 1R15EY028732 (वर्गिस) और एक ब्राइटफोकस फाउंडेशन अनुदान M2019109 (वर्गिस) के माध्यम से एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा प्रदान किया गया था। अतिरिक्त वित्त पोषण यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी के अनुसंधान कार्यालय से एक स्नातक अनुसंधान और रचनात्मक अवसर अनुदान (वेदरस्टन) और यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी के अल्जाइमर रोग और मनोभ्रंश अनुसंधान केंद्र से एक बीज अनुदान (वर्गिस) द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
