Isolamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie suine per la modellazione in vitro
Summary
Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un’alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .
Abstract
L’epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cruciale nella retina esterna responsabile del supporto dei fotorecettori. La degenerazione RPE si verifica comunemente in malattie caratterizzate da perdita progressiva della vista, come la degenerazione maculare legata all’età (AMD). La ricerca sull’AMD spesso si basa sugli occhi di donatori umani o sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per rappresentare l’RPE. Tuttavia, queste fonti di RPE richiedono periodi di differenziazione prolungati e una notevole esperienza per la coltura. Inoltre, alcuni istituti di ricerca, in particolare quelli nelle aree rurali, non hanno un facile accesso agli occhi dei donatori. Sebbene esista una linea cellulare RPE immortalizzata disponibile in commercio (ARPE-19), manca delle caratteristiche essenziali di RPE in vivo e non è ampiamente accettata in molte pubblicazioni di ricerca oftalmologica. C’è un urgente bisogno di ottenere cellule RPE primarie rappresentative da una fonte più prontamente disponibile ed economica. Questo protocollo chiarisce l’isolamento e la sottocoltura di cellule RPE primarie ottenute post-mortem da occhi suini, che possono essere reperite localmente da fornitori commerciali o accademici. Questo protocollo richiede materiali comuni che si trovano tipicamente nei laboratori di coltura tissutale. Il risultato è un’alternativa primaria, differenziata ed economica alle iPSC, agli occhi dei donatori umani e alle cellule ARPE-19.
Introduction
L’epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato situato nella retina esterna tra la membrana di Bruch e i fotorecettori1. Le cellule RPE formano giunzioni strette con proteine come zonula occludens-1 (ZO-1) e possiedono un fenotipo distintivo caratterizzato da pigmentazione e morfologia esagonale 2,3. Queste cellule contribuiscono alla barriera emato-retinica, supportando così la salute dei fotorecettori e mantenendo l’omeostasi retinica 4,5. Inoltre, le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nella visione assorbendo la luce e riciclando i componenti essenziali per i fotorecettori6. Ad esempio, RPE65, una proteina altamente espressa nelle cellule RPE, converte gli esteri retinilici all-trans in retinolo 11-cis 7,8. Data la moltitudine di funzioni svolte dalle cellule RPE, la loro disfunzione è implicata in varie malattie, tra cui la degenerazione maculare legata all’età e la retinopatia diabetica 9,10. Per migliorare la comprensione delle patologie retiniche e sviluppare nuovi trattamenti, vengono spesso utilizzati modelli in vitro della retina.
Per generare modelli rappresentativi di retine sane o malate, è imperativo utilizzare un tipo di cellula RPE mimetica. La linea cellulare ARPE-19 disponibile in commercio manca di fenotipi nativi, come la pigmentazione, mentre le iPSC possono richiedere mesi per differenziarsi 11,12,13. Sebbene gli occhi dei donatori umani possano essere l’ideale, spesso non sono prontamente disponibili per molti laboratori di ricerca.
Qui, abbiamo ideato un metodo per utilizzare gli occhi suini, che condividono molte somiglianze con gli occhi umani14, per ottenere cellule RPE primarie. Queste cellule RPE primarie suine sono state utilizzate in più modelli retinici 15,16. Non solo queste cellule sono convenienti, ma richiedono anche meno tempo per essere acquisite rispetto alle iPSC o agli occhi dei donatori. Inoltre, presentano caratteristiche native, come la pigmentazione e i microvilli. Sebbene esistano protocolli simili per l’estrazione di RPE suina 17,18,19, questa tecnica semplice e dettagliata convalida ulteriormente la dissociazione enzimatica e impiega materiali comunemente trovati nella maggior parte dei laboratori di colture cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come isolare le cellule RPE dagli occhi suini. La pigmentazione e la morfologia del ciottolo sono visibili entro 7 giorni dall’isolamento (Figura 1B). Inoltre, i dati TEER indicano la formazione di giunzioni strette22 e un monostrato sano (Figura 5). Questi risultati mostrano che le cellule RPE isolate con questo metodo sono simili all’RPE umano e possono essere utili nei modelli di coltura cellulare retinica.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Farhad Farjood per l’aiuto con la coltura e l’isolamento di cellule RPE suine e Thomas Harris per l’aiuto con il SEM. Gli autori riconoscono il supporto della Microscopy Core Facility presso la Utah State University per l’analisi SEM. La struttura mantiene un microscopio elettronico a scansione acquisito attraverso una sovvenzione della National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Il finanziamento per questo studio è stato fornito da un National Institutes of Health attraverso la sovvenzione 1R15EY028732 (Vargis) e una sovvenzione della BrightFocus Foundation M2019109 (Vargis). Ulteriori finanziamenti sono stati forniti da una sovvenzione per la ricerca universitaria e le opportunità creative (Weatherston) dell’Ufficio di ricerca della Utah State University e da una sovvenzione iniziale (Vargis) dal Centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer e la demenza della Utah State University.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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