عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الأولية للنمذجة في المختبر
Summary
يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على الخلايا الظهارية الصبغية الأولية للشبكية (RPE) واستزراعها من عيون الخنازير من مصادر محلية. تعمل هذه الخلايا كبديل عالي الجودة للخلايا الجذعية وهي مناسبة لأبحاث الشبكية في المختبر .
Abstract
ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية حاسمة في شبكية العين الخارجية مسؤولة عن دعم المستقبلات الضوئية. يحدث تنكس RPE عادة في الأمراض التي تتميز بفقدان البصر التدريجي ، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD). غالبا ما تعتمد الأبحاث حول AMD على عيون المتبرعين البشريين أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) لتمثيل RPE. ومع ذلك ، تتطلب مصادر RPE هذه فترات تمايز ممتدة وخبرة كبيرة للزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر بعض المؤسسات البحثية ، لا سيما تلك الموجودة في المناطق الريفية ، إلى سهولة الوصول إلى عيون المانحين. على الرغم من وجود خط خلايا RPE الخالد المتاح تجاريا (ARPE-19) ، إلا أنه يفتقر إلى ميزات RPE الأساسية في الجسم الحي وغير مقبول على نطاق واسع في العديد من منشورات أبحاث طب العيون. هناك حاجة ملحة للحصول على خلايا RPE أولية تمثيلية من مصدر متاح بسهولة أكبر وفعال من حيث التكلفة. يوضح هذا البروتوكول عزل الخلايا الأولية RPE التي يتم الحصول عليها بعد الوفاة من عيون الخنازير وثقافتها الفرعية ، والتي يمكن الحصول عليها محليا من الموردين التجاريين أو الأكاديميين. يتطلب هذا البروتوكول مواد شائعة توجد عادة في مختبرات زراعة الأنسجة. والنتيجة هي بديل أساسي ومتمايز وفعال من حيث التكلفة ل iPSCs وعيون المتبرعين البشريين وخلايا ARPE-19.
Introduction
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي طبقة أحادية تقع في شبكية العين الخارجية بين غشاء بروخ والمستقبلات الضوئية1. تشكل خلايا RPE تقاطعات ضيقة مع بروتينات مثل zonula occludens-1 (ZO-1) وتمتلك نمطا ظاهريا مميزا يتميز بالتصبغ والتشكل السداسي 2,3. تساهم هذه الخلايا في الحاجز الدموي الشبكي ، وبالتالي تدعم صحة المستقبلات الضوئية وتحافظ على توازن الشبكية 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب خلايا RPE دورا مهما في الرؤية من خلال امتصاص الضوء وإعادة تدوير المكونات الأساسية للمستقبلات الضوئية6. على سبيل المثال ، RPE65 ، وهو بروتين يتم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا RPE ، يحول استرات الريتينيل المتحولة بالكامل إلى 11-cisretinol 7,8. بالنظر إلى العديد من الوظائف التي تؤديها خلايا RPE ، فإن اختلالها الوظيفي متورط في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر واعتلال الشبكية السكري 9,10. لتعزيز فهم أمراض الشبكية وتطوير علاجات جديدة ، يتم استخدام نماذج في المختبر من شبكية العين بشكل متكرر.
لإنشاء نماذج تمثيلية لشبكية العين السليمة أو المريضة ، من الضروري استخدام نوع خلية RPE محاكاة. يفتقر خط خلايا ARPE-19 المتاح تجاريا إلى الأنماط الظاهرية الأصلية ، مثل التصبغ ، بينما قد تستغرق iPSCs شهورا للتمييزبين 11،12،13. على الرغم من أن عيون المتبرعين البشريين قد تكون مثالية ، إلا أنها غالبا ما تكون غير متاحة بسهولة للعديد من مختبرات الأبحاث.
هنا ، ابتكرنا طريقة لاستخدام عيون الخنازير ، التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع عيون الإنسان14 ، للحصول على خلايا RPE الأولية. تم استخدام خلايا RPE الخنازير الأولية هذه في نماذج شبكية متعددة15,16. هذه الخلايا ليست فعالة من حيث التكلفة فحسب ، بل إنها تتطلب أيضا وقتا أقل للحصول عليها من iPSCs أو عيون المتبرع. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تظهر خصائص أصلية ، مثل التصبغ والزغابات الدقيقة. في حين توجد بروتوكولات مماثلة لاستخراج RPE الخنازير17،18،19 ، فإن هذه التقنية المباشرة والمفصلة تؤكد صحة التفكك الأنزيمي وتستخدم المواد الموجودة عادة في معظم مختبرات زراعة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا RPE عن عيون الخنازير. يظهر التصبغ ومورفولوجيا الحصى في غضون 7 أيام من العزلة (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، تشير بيانات TEER إلى تكوين تقاطع ضيق22 وطبقة أحادية صحية (الشكل 5). تظهر هذه النتائج أن خلايا RPE المعزولة بهذه ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا فرهاد فرجود على المساعدة في زراعة خلايا RPE الخنازير والعزلة وتوماس هاريس للمساعدة في SEM. يقر المؤلفون بالدعم المقدم من مرفق الفحص المجهري الأساسي في جامعة ولاية يوتا لتحليل SEM. يحتفظ المرفق بمجهر إلكتروني ماسح تم الحصول عليه من خلال منحة أجهزة البحث الرئيسية لمؤسسة العلوم الوطنية (CMMI-1337932). تم توفير التمويل لهذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال المنحة 1R15EY028732 (فارغيس) ومنحة مؤسسة برايت فوكس M2019109 (فارغيس). تم توفير تمويل إضافي من خلال منحة البحث والفرص الإبداعية للطلاب الجامعيين (Weatherston) من مكتب الأبحاث بجامعة ولاية يوتا ومنحة أولية (Vargis) من مركز أبحاث مرض الزهايمر والخرف بجامعة ولاية يوتا.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
