Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine entscheidende Monoschicht in der äußeren Netzhaut, die für die Unterstützung von Photorezeptoren verantwortlich ist. RPE-Degeneration tritt häufig bei Krankheiten auf, die durch fortschreitenden Sehverlust gekennzeichnet sind, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Die Forschung zu AMD stützt sich oft auf menschliche Spenderaugen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), um das RPE darzustellen. Diese RPE-Quellen erfordern jedoch längere Differenzierungszeiträume und erhebliches Fachwissen für die Kultivierung. Darüber hinaus haben einige Forschungseinrichtungen, insbesondere in ländlichen Gebieten, keinen einfachen Zugang zu Spenderaugen. Es gibt zwar eine kommerziell erhältliche immortalisierte RPE-Zelllinie (ARPE-19), aber ihr fehlen wesentliche In-vivo-RPE-Eigenschaften und sie wird in vielen ophthalmologischen Forschungspublikationen nicht allgemein akzeptiert. Es besteht ein dringender Bedarf, repräsentative primäre RPE-Zellen aus einer leichter verfügbaren und kostengünstigeren Quelle zu beziehen. Dieses Protokoll erläutert die Isolierung und Subkultur von primären RPE-Zellen, die post mortem aus Schweineaugen gewonnen werden und vor Ort von kommerziellen oder akademischen Lieferanten bezogen werden können. Dieses Protokoll erfordert gängige Materialien, die typischerweise in Gewebekulturlabors zu finden sind. Das Ergebnis ist eine primäre, differenzierte und kostengünstige Alternative zu iPSCs, menschlichen Spenderaugen und ARPE-19-Zellen.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht, die sich in der äußeren Netzhaut zwischen der Bruch-Membran und den Photorezeptorenbefindet 1. RPE-Zellen bilden Tight Junctions mit Proteinen wie Zonula occludens-1 (ZO-1) und besitzen einen charakteristischen Phänotyp, der durch Pigmentierung und hexagonale Morphologie gekennzeichnetist 2,3. Diese Zellen tragen zur Blut-Netzhaut-Schranke bei, wodurch die Gesundheit der Photorezeptoren unterstützt und die Netzhauthomöostase aufrechterhaltenwird 4,5. Darüber hinaus spielen RPE-Zellen eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie Licht absorbieren und wesentliche Komponenten für die Photorezeptoren recyceln6. Zum Beispiel wandelt RPE65, ein Protein, das in RPE-Zellen stark exprimiert wird, all-trans-Retinylester in 11-cis-Retinolum 7,8. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die von RPE-Zellen ausgeführt werden, ist ihre Funktionsstörung an verschiedenen Krankheiten beteiligt, darunter altersbedingte Makuladegeneration und diabetische Retinopathie 9,10. Um das Verständnis von Netzhauterkrankungen zu verbessern und neue Behandlungen zu entwickeln, werden häufig In-vitro-Modelle der Netzhaut eingesetzt.
Um repräsentative Modelle gesunder oder erkrankter Netzhäute zu generieren, ist es zwingend erforderlich, einen mimetischen RPE-Zelltyp zu verwenden. Der kommerziell erhältlichen ARPE-19-Zelllinie fehlen native Phänotypen, wie z. B. Pigmentierung, während die Differenzierung von iPSCs Monate dauern kann 11,12,13. Obwohl menschliche Spenderaugen ideal sein können, sind sie für viele Forschungslabors oft nicht ohne weiteres verfügbar.
Hier haben wir eine Methode entwickelt, um Schweineaugen, die viele Ähnlichkeiten mit menschlichen Augen14 aufweisen, zur Gewinnung primärer RPE-Zellen zu verwenden. Diese primären porcinen RPE-Zellen wurden in mehreren Netzhautmodellen verwendet15,16. Diese Zellen sind nicht nur kostengünstig, sondern benötigen auch weniger Zeit für die Gewinnung als iPSCs oder Spenderaugen. Darüber hinaus weisen sie native Merkmale wie Pigmentierung und Mikrovilli auf. Während ähnliche Protokolle für die RPE-Extraktion von Schweinen existieren 17,18,19, validiert diese einfache und detaillierte Technik die enzymatische Dissoziation weiter und verwendet Materialien, die in den meisten Zellkulturlabors üblich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie RPE-Zellen aus Schweineaugen isoliert werden. Pigmentierung und Kopfsteinpflastermorphologie werden innerhalb von 7 Tagen nach der Isolierung beobachtet (Abbildung 1B). Darüber hinaus deuten die TEER-Daten auf eine Tight-Junction-Bildung22 und eine gesunde Monoschicht hin (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass mit dieser Methode isolierte RPE-Zellen dem menschlichen RPE ähneln und in Netzhautzellku…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Farhad Farjood für die Hilfe bei der RPE-Zellkultur und -isolierung von Schweinen und Thomas Harris für die Hilfe bei SEM. Die Autoren danken der Microscopy Core Facility an der Utah State University für die Unterstützung der REM-Analyse. Die Einrichtung unterhält ein Rasterelektronenmikroskop, das durch einen Zuschuss der National Science Foundation Major Research Instrumentation (CMMI-1337932) erworben wurde. Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch ein National Institutes of Health durch Grant 1R15EY028732 (Vargis) und ein BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Zusätzliche Mittel wurden durch einen Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) des Office of Research der Utah State University und einen Seed Grant (Vargis) des Alzheimer’s Disease and Dementia Research Center der Utah State University bereitgestellt.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
