Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro
Summary
Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.
Abstract
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.
Introduction
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores1. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologiahexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana 4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reciclando componentes essenciais para os fotorreceptores6. Por exemplo, a RPE65, uma proteína altamente expressa em células de EPR, converte ésteres de retinila trans-trans em retinol 11-cis 7,8. Dada a multiplicidade de funções desempenhadas pelas células do EPR, sua disfunção está implicada em várias doenças, incluindo degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética 9,10. Para melhorar a compreensão das patologias retinianas e desenvolver novos tratamentos, modelos in vitro da retina são frequentemente empregados.
Para gerar modelos representativos de retinas saudáveis ou doentes, é imperativo usar um tipo de célula RPE mimética. A linhagem celular ARPE-19 comercialmente disponível não possui fenótipos nativos, como pigmentação, enquanto as iPSCs podem levar meses para se diferenciar11,12,13. Embora os olhos de doadores humanos possam ser ideais, eles muitas vezes não estão prontamente disponíveis para muitos laboratórios de pesquisa.
Aqui, desenvolvemos um método para utilizar olhos suínos, que compartilham muitas semelhanças com olhos humanos14, para a obtenção de células primárias do EPR. Essas células primárias do EPR suíno têm sido utilizadas em múltiplos modelos de retina15,16. Essas células não são apenas custo-efetivas, mas também requerem menos tempo para serem adquiridas do que as iPSCs ou os olhos de doadores. Além disso, apresentam características nativas, como pigmentação e microvilosidades. Embora existam protocolos semelhantes para extração de EPR suíno 17,18,19, essa técnica simples e detalhada valida ainda mais a dissociação enzimática e emprega materiais comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction22 e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Farhad Farjood pela ajuda com a cultura e isolamento de células de EPR suíno e a Thomas Harris pela ajuda com MEV. Os autores agradecem o apoio do Microscopy Core Facility da Utah State University para a análise de MEV. A instalação mantém um microscópio eletrônico de varredura adquirido através de uma National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). O financiamento para este estudo foi fornecido por um National Institutes of Health através do Grant 1R15EY028732 (Vargis) e um BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). O financiamento adicional foi fornecido por uma Bolsa de Pesquisa de Graduação e Oportunidades Criativas (Weatherston) do Escritório de Pesquisa da Universidade Estadual de Utah e uma bolsa de sementes (Vargis) do Centro de Pesquisa de Doença de Alzheimer e Demência da Universidade Estadual de Utah.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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