Isolering av primära epitelceller med svinretinalt pigment för in vitro-modellering
Summary
Detta protokoll beskriver proceduren för att erhålla och odla primära retinala pigmentepitelceller (RPE) från lokalt framställda grisögon. Dessa celler fungerar som ett högkvalitativt alternativ till stamceller och är lämpliga för in vitro-näthinneforskning.
Abstract
Näthinnans pigmentepitel (RPE) är ett viktigt monolager i den yttre näthinnan som ansvarar för att stödja fotoreceptorer. RPE-degeneration förekommer vanligtvis vid sjukdomar som kännetecknas av progressiv synförlust, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Forskning om AMD förlitar sig ofta på mänskliga donatorögon eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) för att representera RPE. Dessa RPE-källor kräver dock förlängda differentieringsperioder och betydande expertis för odling. Dessutom saknar vissa forskningsinstitutioner, särskilt på landsbygden, enkel tillgång till donatorögon. Även om det finns en kommersiellt tillgänglig immortaliserad RPE-cellinje (ARPE-19), saknar den viktiga RPE-egenskaper in vivo och är inte allmänt accepterad i många oftalmologiska forskningspublikationer. Det finns ett stort behov av att få representativa primära RPE-celler från en mer lättillgänglig och kostnadseffektiv källa. Detta protokoll belyser isolering och subkultur av primära RPE-celler erhållna efter döden från grisögon, som kan köpas lokalt från kommersiella eller akademiska leverantörer. Detta protokoll kräver vanliga material som vanligtvis finns i vävnadsodlingslaboratorier. Resultatet är ett primärt, differentierat och kostnadseffektivt alternativ till iPSCs, mänskliga donatorögon och ARPE-19-celler.
Introduction
Det retinala pigmentepitelet (RPE) är ett monolager som ligger i den yttre näthinnan mellan Bruchs membran och fotoreceptorerna1. RPE-celler bildar täta förbindelser med proteiner som zonula occludens-1 (ZO-1) och har en distinkt fenotyp som kännetecknas av pigmentering och hexagonal morfologi 2,3. Dessa celler bidrar till blod-näthinnebarriären och stöder därigenom fotoreceptorhälsan och upprätthåller retinal homeostas 4,5. Dessutom spelar RPE-celler en avgörande roll för synen genom att absorbera ljus och återvinna viktiga komponenter för fotoreceptorerna6. Till exempel omvandlar RPE65, ett protein som uttrycks i hög grad i RPE-celler, all-trans-retinylestrar till 11-cis-retinol 7,8. Med tanke på de många funktioner som utförs av RPE-celler är deras dysfunktion inblandad i olika sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration och diabetisk retinopati 9,10. För att öka förståelsen för näthinnepatologier och utveckla nya behandlingar används ofta in vitro-modeller av näthinnan.
För att generera representativa modeller av friska eller sjuka näthinnor är det absolut nödvändigt att använda en mimetisk RPE-celltyp. Den kommersiellt tillgängliga ARPE-19-cellinjen saknar naturliga fenotyper, såsom pigmentering, medan iPSCs kan ta månader att differentiera 11,12,13. Även om mänskliga donatorögon kan vara idealiska, är de ofta inte lättillgängliga för många forskningslaboratorier.
Här har vi tagit fram en metod för att använda grisögon, som har många likheter med mänskliga ögon14, för att få fram primära RPE-celler. Dessa primära RPE-celler från svin har använts i flera näthinnemodeller 15,16. Dessa celler är inte bara kostnadseffektiva, utan de kräver också mindre tid att förvärva än iPSC eller donatorögon. Dessutom uppvisar de naturliga egenskaper, såsom pigmentering och mikrovilli. Även om liknande protokoll för RPE-extraktion från svin finns 17,18,19, validerar denna enkla och detaljerade teknik ytterligare enzymatisk dissociation och använder material som vanligtvis finns i de flesta cellodlingslaboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man isolerar RPE-celler från grisögon. Pigmentering och kullerstensmorfologi ses inom 7 dagar efter isolering (Figur 1B). Dessutom tyder TEER-data på att det bildas en tät korsning22 och ett friskt monolager (figur 5). Dessa resultat visar att RPE-celler som isolerats med denna metod liknar human RPE och kan vara till nytta i retinala cellodlingsmodeller.
Ögonen som används i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Farhad Farjood för hjälp med grisodling och isolering av RPE-celler och Thomas Harris för hjälp med SEM. Författarna erkänner stödet från Microscopy Core Facility vid Utah State University för SEM-analysen. Anläggningen har ett svepelektronmikroskop som förvärvats genom ett National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansieringen av denna studie tillhandahölls av ett National Institutes of Health genom anslag 1R15EY028732 (Vargis) och ett BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Ytterligare finansiering tillhandahölls av ett stipendium för grundutbildning och kreativa möjligheter (Weatherston) från Utah State Universitys forskningskontor och ett såddbidrag (Vargis) från Utah State Universitys forskningscenter för Alzheimers sjukdom och demens.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
