胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。
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この記事について
サマリー
要約
胃患者由来オルガノイド(PDO)は、胃の生物学と病理学を研究するためのユニークなツールを提供します。その結果、これらのPDOは、幅広い研究用途での使用が増加しています。しかし、標準化された初期細胞播種密度を維持しながら、単一細胞消化物から胃PDOを産生するための公表されたアプローチは不足しています。このプロトコルでは、重点は隔離された単一細胞からの胃のオルガノイドの開始および分裂によってオルガノイドを継代の方法の提供にある。重要なことに、このプロトコルは、最初の細胞播種密度への標準化されたアプローチが、良性の生検組織から胃オルガノイドを一貫して生成し、オルガノイド増殖の標準化された定量化を可能にすることを示しています。最後に、胃PDOは、オルガノイドが体の生検に由来するか、胃の胞状領域に由来するかに基づいて、さまざまな形成速度と増殖速度を示すという新しい観察結果を裏付ける証拠があります。具体的には、オルガノイド開始に門生検組織を使用すると、胃本体の生検から生成されたオルガノイドと比較して、より多くのオルガノイドが形成され、20日間にわたってオルガノイドの成長が速くなることが明らかになりました。本明細書に記載されているプロトコルは、研究者に胃PDOを正常に生成および操作するためのタイムリーで再現性のある方法を提供します。
概要
オルガノイドは、オルガノイドの元となった器官の構造や機能に似た、ミニチュアの3次元(3D)細胞構造です1,2。これらのラボで培養されたモデルは、幹細胞または組織特異的細胞を制御された環境で培養することによって作成され、これらの細胞が自己組織化してさまざまな細胞型に分化できるようにします1,2,3。オルガノイドの主な利点の1つは、従来の2次元(2D)細胞培養よりもヒトの生物学をより詳細に再現できることです1,2,3。特に、ヒトオルガノイドは、その起源組織の遺伝的多様性を維持することが示されている3,4,5。オルガノイドは、ヒトの臓器発生を研究し、疾患をモデル化し、制御された実験室環境で潜在的な治療法をテストするユニークな機会を提供します。さらに、オルガノイドは個々....
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プロトコル
このプロトコルで利用されるすべてのヒト組織は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(IRB#842961)によって承認された胃組織収集研究を通じて、組織収集にインフォームドコンセントを提供した個人から収集されました。この研究の参加者は、日常的なケアの一環として上部内視鏡検査を受け、18歳以上であり、インフォームドコンセントを提供できる必要がありました。実施されたすべての研究は、ペンシルベニア大学が定めたガイドラインに準拠しています。
1. 実験準備
- 前述のように、コンディショニングされたL-WRNメディアを準備します16.必須ではありませんが、コンディショニング培地に含まれるWnt-3A、R-spondin、およびnogginの濃度は、メーカーの指示に従って市販のELISAキットを使用して確認できます( 材料表を参照)。
- RPMI-抗生物質(RPMI-ABX)、PBS-抗生物質(PBS-ABX)、PBS-ジチオスレイトール(PBS-DTT)、消化バッファー、および胃オルガノイド培地を調製します(詳細な組成については 補足表1 を参照)。胃オルガノイド培地は4°Cで1週間安定です。
- オートクレーブ鉗子、細かい解剖ハサミ、1.5 mLチューブ。
- 基底膜マトリ....
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結果
その後の代表的な結果は、上部内視鏡検査を受けている5人の異なる患者の胃本体と胃の前部領域の両方の良性上皮から採取された生検から得られます。2〜4個の「ドーム」/ウェルを播種し、胃小体生検と前庭生検の両方について患者ごとに分析しました。オルガノイドは、5人の患者全員の胃体と胃前庭部生検組織から正常に生成されました。平均して、41のオルガノイドが「ドーム」/ウェルあたり分析されました。すべての画像は共焦点顕微鏡を使用して取得されたz投影であり、オルガノイドのサイズと球形度の定量化は、市販の画像解析ソフトウェアを使用して行われました( 材料表を参照)。
オルガノイドは一般に、単一細胞の播種後10日以内に同定可能です(図3A)。20日目までに、オルガノイドは大きくなり、通常は継代する必要があります。単一細胞播種後に形成されるオルガノイドの数は多少変動する可能性がありますが、体生検および幽閉胃生検から形成されるオルガノイドの数について予想される結果を 図3B.......
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ディスカッション
本明細書では、胃本体および前庭部からの良性上皮の生検から単離された単一細胞からヒト胃オルガノイドを確実に生成するための詳細なプロトコルが概説される。プロトコルの重要なステップは、タイミングと基底膜マトリックスの取り扱いを中心に展開します。生存率を維持するためには、生検組織を取得した後、できるだけ早くプロトコルを開始することが不可欠です。目的は、生検が実施されてから30分以内に生検組織の消化を開始することです。また、基底膜マトリックスの取り扱いも困難な場合があります。氷の上で解凍すると、液体のままです。ただし、4°Cを超える温度では重合します。したがって、基底膜マトリックスを氷から迅速に移し替えて、単一細胞またはオルガノイド断片と混合して「ドーム」をプレーティングすることは、1分以内に重合を開始するため、迅速に行う必要があります。チューブ内で重合すると、ピペットチップに吸引することはできません。これが発生した場合は、マトリゲルが解重合して液体に戻るまで、チューブを氷上に置くことができます。ピペッティングを静かに上下させて単一細胞またはオルガノイド断片を基底膜マトリックスと混合する場合、気泡を発生させないことも重要です。基底膜マトリックス「.......
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開示事項
著者らは関連する開示をしていない。
謝辞
ペンシルベニア大学ゲノム医学T32 HG009495(KHB)、NCI R21 CA267949(BWK)、Basser Center for BRCAの男性とBRCAプログラム(KHB、BWK)、デグレゴリオファミリー財団助成賞(BWK)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% トリプシン EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| アムホテリシン B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| ディスパーゼ II | Σ | D4693-1G | |
| ジチオスレイトール (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 菌類 | InvivoGen | NC9326704 | |
| ガストリン I | Σ Aldrich | G9145 | |
| ゲンタマイシン | 1570060 | ||
| グルタマックス | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN 細胞株 | ATCC | CRL-3276 | |
| マトリゲル | コーニング | 47743-715 | |
| メトロニダゾール | MP バイオメディカル | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA キット | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen 連鎖球菌 | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA キット | R&Dシステム | ズDY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISAキット | R&Dシステムズ | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma アルドリッチ | Y0503 |
参考文献
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al.
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再版と許可
