मधुमेह रेटिनोपैथी से संबंधित अपमान जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स से मृत्यु के लिए रेटिना वाहिका की लचीलापन की निगरानी के लिए एक सुरक्षा परख विकसित की गई थी।
डायबिटिक रेटिनोपैथी (डीआर) एक जटिल और प्रगतिशील ओकुलर बीमारी है जो इसके रोगजनन में दो अलग-अलग चरणों की विशेषता है। पहले चरण में रेटिना को मधुमेह से प्रेरित क्षति से सुरक्षा का नुकसान शामिल है, जबकि दूसरा चरण इस क्षति के संचय पर केंद्रित है। पारंपरिक परख मुख्य रूप से केशिका अध: पतन के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो क्षति की गंभीरता का संकेत है, अनिवार्य रूप से डीआर के दूसरे चरण को संबोधित करता है। हालांकि, वे केवल अप्रत्यक्ष रूप से अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि क्या रेटिना वास्कुलचर के सुरक्षात्मक तंत्र से समझौता किया गया है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, रेटिना के सुरक्षात्मक तंत्र का सीधे आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया गया था – विशेष रूप से, ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स जैसे मधुमेह से प्रेरित अपमान के खिलाफ इसकी लचीलापन। यह सुरक्षा परख, हालांकि शुरू में मधुमेह रेटिनोपैथी के लिए डिज़ाइन किया गया था, दोनों शारीरिक और रोग संदर्भों में व्यापक अनुप्रयोगों की क्षमता रखता है। सारांश में, मधुमेह रेटिनोपैथी के रोगजनन को समझने में सुरक्षा हानि और क्षति संचय के दोहरे चरणों को पहचानना शामिल है, इस अभिनव सुरक्षा परख के साथ अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करना और संभावित रूप से अन्य चिकित्सा स्थितियों तक विस्तार करना।
डायबिटिक रेटिनोपैथी (डीआर) डायबिटीज मेलिटस (डीएम) की माइक्रोवैस्कुलर जटिलताओं में से एक है, औरविकसित देशों में कामकाजी उम्र के व्यक्तियों में अंधेपन का प्रमुख कारण है। डायबिटिक रेटिनोपैथी के लिए प्रमुख जोखिम कारक हाइपरग्लेसेमिया 2,3,4 की अवधि और डिग्री हैं। जबकि डीएम रेटिना5 के संवहनी और तंत्रिका दोनों घटकों की शिथिलता का कारण बनता है, डीआर का निदान रेटिना वास्कुलचर6 की रूपात्मक विशेषताओं पर आधारित है।
हाइपरग्लेसेमिया-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव डीआर रोगजनन7 के ड्राइवरों में से एक है। ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि से व्यापक क्षति होती है, जो माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यक्षमता से समझौता करती है और इस तरह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर को और बढ़ाती है। ये घटनाएं रेटिना वाहिकाओं के रिसाव, भड़काऊ साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि और रेटिना के भीतर तंत्रिका और संवहनी कोशिका दोनों प्रकारों की मृत्यु के साथ होती हैं। संवहनी कोशिकाओं का नुकसान, और इसलिए रेटिना के व्यापक केशिका नेटवर्क की कार्यक्षमता, हाइपोक्सिया में परिणाम, प्रतिक्रियाओं की एक किस्म के लिए एक शक्तिशाली उत्तेजना5. इस तरह की प्रतिक्रियाओं में संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) की अभिव्यक्ति में वृद्धि शामिल है जो पारगम्यता और एंजियोजेनेसिस दोनों को चलाती है, डीआर के उन्नत, दृष्टि-धमकी देने वाले चरणों की कार्डिनल विशेषताएं – मधुमेह धब्बेदार एडिमा, और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी6.
डीआर की कुछ विशेषताएं बताती हैं कि एक जीव (दोनों रोगियों और प्रयोगात्मक जानवरों) में इस संकेत का विरोध करने की आंतरिक क्षमता होती है। दृष्टि-धमकी देने वाले डीआर 8,9,10,11,12,13 विकसित करने से पहले मरीजों को डीएम के कई दशकों का अनुभव होता है। जबकि डीएम के कृंतक मॉडल डीआर14 के उन्नत, दृष्टि-धमकी देने वाले चरणों को विकसित नहीं करते हैं, डीआर का प्रारंभिक/हल्का रूप जो प्रकट होता है वह डीएम15,16 के हफ्तों या महीनों की अवधि के बाद ही ऐसा करता है। इसके अलावा, रोगियों और प्रयोगात्मक जानवरों दोनों में, डीआर प्रगतिशील है, और डीएम की अवधि लंबे समय तक बढ़ने के साथ रेटिना की शिथिलता / क्षति बढ़ जाती है। अंत में, डीएम के साथ कुछ रोगी कभी भी डीआर विकसित नहीं करते हैं। कुछ उदाहरणों में, ऐसा इसलिए है क्योंकि ऐसे व्यक्तियों को डीआर विकसित होने के लिए लंबे समय तक मधुमेह का अनुभव नहीं होता है। अन्य उदाहरणों में, ऐसा इसलिए है क्योंकि वे डीआर के लिए असाधारण प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं; जैसा कि मेडलिस्ट अध्ययन के प्रतिभागियों के साथ होता है, जो डीएम17 के 50 या अधिक वर्षों के बाद डीआर विकसित नहीं करते हैं। डीआर से सुरक्षा के अस्तित्व और इसकी विशाल अनुवाद संबंधी प्रासंगिकता के लिए इस तरह के सम्मोहक समर्थन के बावजूद, अंतर्निहित सुरक्षा तंत्र की आक्रामक जांच नहीं की गई है।
इस के साथ वर्णित संरक्षण परख क्यों मधुमेह चूहों में डीएम की शुरुआत से डॉ देरी हो रही है की जांच की सुविधा के लिए विकसित किया गया था. डीएम और गैर-डीएम चूहों पर लागू इस परख के प्रमुख चरणों में (1) आंख (पूर्व विवो या विवो में) के लिए एक उप-अधिकतम मृत्यु-उत्प्रेरण अपमान प्रदान करना, (2) रेटिना वाहिका को अलग करना, (3) ट्यूनल और डीएपी के साथ वास्कुलचर को धुंधला करना, (4) परिणामी छवियों को चित्रित करना और ट्यूनल / डीएपीआई डबल-पॉजिटिव प्रजातियों के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करना।
इस अध्ययन में, डीएम / डीआर से संबंधित अपमान जैसे इस्किमिया / ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स द्वारा प्रेरित मृत्यु के लिए रेटिना वास्कुलचर के प्रतिरोध / भेद्यता का पता लगाने के लिए एक परख स्थापित की गई थी। इस पांडुलिपि कई प्रकाशित प्रोटोकॉल 19,20,21 का एक संशोधन है जो इस परख, का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है.
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। सबसे पहले, रेटिना को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करना अनिवार्य है, संवहनी नेटवर्क के संरक्षण को सुनिश्चित करना और पर्याप्त आँसू को रोकना। यह एक चीरा बनाने के द्वारा पूरा किया जा सकता है 2-3 लिंबस करने के लिए मिमी पीछे रेटिना कसकर ओरा सेराटा का पालन करता है, और यह अलग चुनौतीपूर्ण है. दूसरा, पूरी प्रक्रिया में वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में इन उपकरणों को डुबोकर ट्रिप्सिन के साथ जहाजों (जैसे, सिंगल-हेयर ब्रश, ट्रांसफिंग पिपेट और संदंश) के संपर्क में आने वाले सभी उपकरणों को कोट करें। यह इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों का पालन करने से वास्कुलचर को रोकता है। तीसरा, क्योंकि माइक्रोवैस्कुलचर सामान्य प्रकाश के तहत लगभग अदृश्य है, आकस्मिक नुकसान को रोकने के लिए मलबे की आकांक्षा और माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरण के दौरान बढ़ी हुई सतर्कता की आवश्यकता होती है।
रेटिना की विभिन्न परतों के एंजाइमेटिक पाचन की एक उपयुक्त डिग्री महत्वपूर्ण है; अपर्याप्त पाचन संवहनी नेटवर्क से न्यूरोनल ऊतक को अलग करने से रोकता है, जबकि अत्यधिक पाचन संवहनी जाल को भंग कर देता है। 1 घंटे19 से रात भर 23 तक के विभिन्न पाचन समय की सूचना दी गई है। टिप्पणियों के आधार पर, 4 घंटे और 15 मिनट का पाचन समय 2 घंटे, 3 घंटे और 4 घंटे की अवधि की तुलना में सबसे अनुकूल परिणाम देता है। इस बिंदु से परे पाचन को लम्बा करना प्रक्रिया को बढ़ाने की संभावना नहीं है और इसके बजाय वाहिका की अखंडता से समझौता कर सकता है।
ऐसे मामलों में जहां पचाने वाला रेटिना सिंगल-हेयर ब्रश का पालन करता है, बालों को वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में कई बार डुबोएं। यह ब्रश के चिपचिपे क्षेत्रों को कम करता है। यदि हेयरब्रश अभी भी संवहनी ऊतक का पालन करता है, तो कांच के अवशिष्ट टुकड़ों के लिए इसका निरीक्षण करें, और उन्हें संदंश के साथ हटा दें।
पूर्ण कांच के हटाने के लिए इष्टतम क्षण फोटोरिसेप्टर को खत्म करने के बाद है, लेकिन शेष तंत्रिका और ग्लियल ऊतक को हटाने से पहले। फोटोरिसेप्टर हटाए जाने तक रेटिना कठोरता बनाए रखता है। इस स्तर पर कांच का निष्कर्षण संभावित रूप से रेटिना/वाहिका को फाड़ सकता है। अवशिष्ट तंत्रिका और ग्लियल ऊतक की नाजुक परतें संवहनी संरचना के घुमावदार रूप को संरक्षित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। वे रेटिना को उसके केंद्र में फाड़ने से रोकते हैं जब विट्रियस ऑप्टिक तंत्रिका से अलग हो जाता है।
यदि पृथक वास्कुलचर माइक्रोस्कोप स्लाइड का बिल्कुल भी पालन नहीं करता है, तो यह इंगित करता है कि स्लाइड का वह भाग जहां आसंजन होने की उम्मीद है, गंदा है। एक चिपचिपा स्थान का पता लगाने के लिए स्लाइड की सतह पर जहाजों को स्थानांतरित करने का प्रयास करें, एक अलग स्लाइड पर स्विच करें या स्लाइड को सावधानीपूर्वक साफ करें और फिर से प्रयास करें। यदि बर्तन अपने कटोरे जैसी आकृति में फहराने से पहले स्लाइड से चिपक जाते हैं, तो स्लाइड से वास्कुलचर को उठाएं ताकि यह एक बार फिर पानी में स्वतंत्र रूप से तैर सके। इस चरण को संदंश के साथ करें जिसे बार-बार वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में डुबोया गया है।
वास्कुलचर को अलग करने के लिए कई वैकल्पिक तकनीकों की सूचना दी गई है, जो यहां वर्णित सुरक्षा परख के लिए उपयुक्त नहीं होगी। उदाहरण के लिए, आसमाटिक lysis ऊतक24,25 की जैव रासायनिक जांच की सुविधा, unfixed रेटिना नमूनों से vasculature को अलग करने के लिए नियोजित किया गया है. हालांकि, यह प्रक्रिया वास्कुलचर की शारीरिक रचना के साथ-साथ इस लेख में नियोजित दृष्टिकोण को संरक्षित नहीं कर सकती है। इसी तरह, जबकि माइक्रोवैस्कुलचर के बड़े खंडों को अलग करने के लिए ऊतक प्रिंट विधि वाहिका के इलेक्ट्रोटोनिक वास्तुकला26 के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, पूरे संवहनी बिस्तर को आमतौर पर पुनर्प्राप्त नहीं किया जाता है।
यह परख विकसित की गई थी क्योंकि केशिका अध: पतन की निगरानी के लिए मौजूदा दृष्टिकोण सुरक्षा के मुद्दे को संबोधित नहीं करते हैं। केशिका अध: पतन, जो लंबे समय तक डीएम के बाद होता है, इंगित करता है कि क्या डीआर विकसित हुआ है। डीआर का निदान करने के अलावा, यह परिणाम यह आकलन करने के लिए उपयोगी है कि क्या कोई एजेंट / हालांकि, मौजूदा केशिका अध: पतन परख एजेंट की कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र से बात नहीं करते हैं। ऐसा एजेंट रोग संबंधी घटनाओं को रोक सकता है जो डीआर को बढ़ाते हैं जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव या साइटोकिन्स। वैकल्पिक रूप से, एजेंट ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स के प्रति लचीलापन बढ़ाकर सुरक्षा लागू कर सकता है और/या क्षति की मरम्मत को बढ़ावा दे सकता है। इस नई सुरक्षा परख का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि किसी दिए गए चिकित्सा के लाभकारी प्रभाव में अंतर्जात प्रणाली को लागू करना शामिल है जो डीएम से संबंधित मौत से बचाता है।
इस सुरक्षा परख का एक दोष यह है कि यह रेटिना वाहिकाओं के भीतर दो सेल प्रकारों को अलग नहीं करता है: एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) और पेरिसाइट्स (पीसी)। जबकि पीएएसएच-दाग वाले वर्गों में उनके नाभिक की उपस्थिति सेल-प्रकार विशिष्ट (चित्रा 6) है, प्रत्येक नाभिक नैदानिक विशेषताओं को प्रदर्शित नहीं करता है। नाभिक के लगभग 30% को कम से कम भाग में ईसी या पीसी के रूप में स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं किया जा सकता है क्योंकि पीएएसएच-दाग वाले नमूनों से प्राप्त द्वि-आयामी छवियां संवहनी जाल की त्रि-आयामी संरचना को अपूर्ण रूप से हल करती हैं। इस बाधा को अतिरिक्त विश्लेषण द्वारा पार किया जा सकता है जैसे कि सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। ऐसी छवियां, जो दो सेल प्रकारों को अलग करती हैं, प्रत्येक संवहनी कोशिका प्रकारों के प्रतिरोध / भेद्यता को निर्धारित करने के लिए ट्यूनल के साथ सह-दाग हो सकती हैं।
यह संवहनी-केंद्रित परख तंत्रिका रेटिना के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है। ऐसी जानकारी प्रदान करने के लिए अतिरिक्त परख विकसित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, रेटिना वाहिका को अलग करने के बजाय, पूरे रेटिना का एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है और फिर प्रतिरोध / भेद्यता के लिए (फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा) विश्लेषण किया जा सकता है। कोशिका मृत्यु के संकेतकों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों (तंत्रिका और संवहनी दोनों) को शामिल करने से रेटिना सेल प्रकारों की एक और पूरी तस्वीर प्रदान की जाएगी जिसमें डीएम / डीआर-मध्यस्थता वाली मौत से सुरक्षा की क्षमता है।
अंत में, यहां वर्णित सुरक्षा परख डीएम की शुरुआत और चूहों में डीआर की अभिव्यक्ति के बीच देरी के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को इलिनोइस सोसाइटी टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (EY031350 और EY001792) से अनुदान और रिसर्च टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस फाउंडेशन से एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |