Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.
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Artículo de método
Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente
En este artículo
Resumen
Resumen
La señalización del calcio es un regulador integral de casi todos los tejidos. Dentro del epitelio intestinal, el calcio está involucrado en la regulación de la actividad secretora, la dinámica de la actina, las respuestas inflamatorias, la proliferación de células madre y muchas otras funciones celulares no caracterizadas. Como tal, el mapeo de la dinámica de señalización del calcio dentro del epitelio intestinal puede proporcionar información sobre los procesos celulares homeostáticos y revelar respuestas únicas a diversos estímulos. Los organoides intestinales humanos (HIO) son un modelo de alto rendimiento derivado del ser humano para estudiar el epitelio intestinal y, por lo tanto, representan un sistema útil para investigar la dinámica del calcio. Este artículo describe un protocolo para transducir de manera estable HIOs con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), realizar microscopía de fluorescencia en vivo y analizar datos de imágenes para caracterizar significativamente las señales de calcio. Como ejemplo representativo, las OHIO tridimensionales se transducieron con lentivirus para expresar de forma estable GCaMP6s, una GECI citosólica verde fluorescente basada en proteínas. A continuación, las OHIO modificadas se dispersaron en una suspensión unicelular y se sembraron como monocapas. Después de la diferenciación, las monocapas de HIO se infectaron con rotavirus y/o se trataron con fármacos que se sabe que estimulan una respuesta de calcio. Un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara de imágenes en vivo humidificada y con temperatura controlada permitió obtener imágenes a largo plazo de monocapas infectadas o tratadas con medicamentos. Después de la obtención de imágenes, las imágenes adquiridas se analizaron utilizando el software de análisis disponible gratuitamente, ImageJ. En general, este trabajo establece una línea adaptable para caracterizar la señalización celular en HIO.
Introducción
El calcio es un segundo mensajero ampliamente conservado que desempeña un papel fundamental en laregulación de la fisiología celular. Dada su fuerte carga, su pequeño tamaño y su alta solubilidad en condiciones fisiológicas, el calcio es un manipulador ideal de la conformación de las proteínas. Esto hace que el calcio sea un medio poderoso para transducir señales electroquímicas en alteraciones enzimáticas, transcripcionales o postranscripcionales. Los estrictos gradientes de concentración de calcio a través del retículo endoplásmico (RE) y las membranas plasmáticas crean una alta fuerza impulsora que permite cambios rápidos en la concentración....
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Protocolo
Todos los organoides intestinales humanos (HIO) utilizados en este protocolo y los experimentos representativos se derivaron de tejido humano obtenido y mantenido por el Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas. Todas las muestras se recolectaron de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Baylor College of Medicine.
1. Preparación de materiales y reactivos
- Para el mantenimiento de organoides, reúna placas de 24 pocillos tratadas con cultivos celulares, matriz de membrana basal (BMM), tubos cónicos de 15 ml y tubos cónicos de 1,5 ml.
- Para prep....
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Resultados
La Figura 1A muestra una cúpula de BMM que contiene organoides intestinales humanos tridimensionales que han sido transducidos para expresar de forma estable GCaMP6s. La Figura 1B muestra la misma línea de organoide resarvida como monocapa a las 24, 48 y 72 h después de la siembra. Para validar la función de GCaMP6s, se obtuvieron imágenes de la monocapa mediante microscopía de fluorescencia cada 2 s durante 4 min, y se añadieron 100 nM de ADP al medio después d.......
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Discusión
Las alteraciones en los niveles citosólicos de Ca2+ pueden ser tanto causa como efecto de patologías dentro del epitelio 10,16,17. Los aumentos en el calcio citosólico pueden impulsar directamente la secreción a través de la activación del canal de cloruro dependiente de calcio TMEM16A18,19. La activación de TMEM16A en respuesta a Ca2+ permite el ef.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones R01DK115507 y R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El apoyo de los aprendices fue proporcionado por el F30DK131828 de subvenciones de los NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) y F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Nos gustaría agradecer al Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas por proporcionar los medios de mantenimiento de organoides.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM Avanzado F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Tripsina EDTA | Gibco | ||
| 0.05% Tripsina EDTA | Gibco | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisherbrand 5408137 | ||
| tubos cónicos de 15 ml | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% de formaldehído | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Aguja de calibre 25 | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco 12634028 | ||
| Antibiótico-antimicocítico | Gibco | 15240062 | |
| Antibiótico-antimicótico | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suplemento | Gibco | 17504-044 | |
| Albúmina sérica bovina | FisherScientific | ||
| Portaobjetos de cultivo celular CellView, PS, 75/25 MM, fondo de cristal, 10 compartimentos | Greiner | 543979 | |
| Colágeno IV | Sigma | Aldrich C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning 46-034-CI | ||
| Suero fetal bovino | Corning | 35010CV | |
| Suero fetal bovino | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrito | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | ||
| GlutaMAX | Gibco | ||
| Factor de crecimiento epidérmico humano | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Suplemento | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Placas de 24 pocillos tratadas | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReactivos | BP151100 | |
| Enzima TrypLE Express, rojo sin fenol | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Tripsina | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
Referencias
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
