Epon Post indlejring korrelativt lys og elektronmikroskopi
Summary
Vi præsenterer en detaljeret protokol for Epon post-embedding korrelativt lys og elektronmikroskopi ved hjælp af et fluorescerende protein kaldet mScarlet. Denne metode kan opretholde fluorescensen og ultrastrukturen samtidigt. Denne teknik er egnet til en lang række biologiske anvendelser.
Abstract
Korrelativ lys og elektronmikroskopi (CLEM) er en omfattende mikroskopi, der kombinerer lokaliseringsoplysningerne fra fluorescensmikroskopi (FM) og konteksten af cellulær ultrastruktur erhvervet ved elektronmikroskopi (EM). CLEM er en afvejning mellem fluorescens og ultrastruktur, og normalt kompromitterer ultrastruktur fluorescens. Sammenlignet med andre hydrofile indlejringsharpikser, såsom glycidylmethacrylat, HM20 eller K4M, er Epon overlegen i ultrastrukturbevarelse og sektionsegenskaber. Tidligere havde vi vist, at mEosEM kan overleve osmiumtetroxidfiksering og Epon-indlejring. Ved hjælp af mEosEM opnåede vi for første gang Epon post embedding CLEM, som opretholder fluorescensen og ultrastrukturen samtidigt. Her giver vi trinvise detaljer om EM-prøveforberedelsen, FM-billeddannelsen, EM-billeddannelsen og billedjusteringen. Vi forbedrer også procedurerne for identifikation af den samme celle, der afbildes af FM-billeddannelse under EM-billeddannelsen, og beskriver registreringen mellem FM- og EM-billederne. Vi mener, at man nemt kan opnå Epon efter indlejring af korrelativt lys og elektronmikroskopi efter denne nye protokol i traditionelle EM-faciliteter.
Introduction
Fluorescensmikroskopi (FM) kan anvendes til at opnå lokalisering og distribution af målproteinet. Imidlertid går konteksten, der omgiver målproteinet, tabt, hvilket er afgørende for at undersøge målproteinet grundigt. Elektronmikroskopi (EM) har den højeste billedopløsning, hvilket giver flere subcellulære detaljer. Ikke desto mindre mangler EM målmærkning. Ved nøjagtigt at fusionere fluorescensbilledet taget af FM med det grå billede erhvervet af EM, kan korrelativt lys og elektronmikroskopi (CLEM) kombinere informationen opnået ved disse to billeddannelsestilstande 1,2,3,4.
CLEM er en afvejning mellem fluorescens og ultrastrukturen1. På grund af begrænsningerne i nuværende fluorescerende proteiner og de traditionelle EM-prøveforberedelsesprocedurer, især brugen af osminsyre (OsO4) og hydrofobe harpikser som Epon, kompromitterer ultrastrukturen altid fluorescens5. OsO4 er et uundværligt reagens i EM-prøveforberedelse, som bruges til at forbedre kontrasten i EM-billeder. Sammenlignet med andre indlejringsharpikser er Epon overlegen i ultrastrukturbevaring og sektionsegenskaber5. Imidlertid kan ingen fluorescerende proteiner bevare fluorescenssignalet efter behandlingen af OsO4 og Epon indlejring6. For at overvinde begrænsningerne ved fluorescerende proteiner blev der udviklet præindlejring af CLEM, hvor FM-billeddannelse udføres før EM-prøveforberedelse6. Ulempen ved præintegrering af CLEM er imidlertid den upræcise registrering mellem FM- og EM-billederne5.
Tværtimod udfører CLEM-metoden efter indlejring FM-billeddannelse efter EM-prøveforberedelsen, hvis registreringsnøjagtighed kan nå 6-7 nm 5,6. For at bevare fluorescensen af fluorescerende proteiner er meget lave koncentrationer af OsO4 (0,001%)3 eller højtryksfrosne (HPF) og frysesubstitutionsmetoder (FS) EM-præparationsmetoder 4,7 blevet anvendt på bekostning af kompromitteret ultrastruktur eller kontrasten i EM-billedet. Udviklingen af mEos4b fremmer i høj grad udviklingen af post embedding CLEM, selvom glycidylmethacrylat anvendes som indlejringsharpiks5. Med udviklingen af mEosEM, som kan overleve OsO4-farvning og Epon-indlejring, blev Epon post-embedding superopløsnings-CLEM opnået for første gang og opretholdt fluorescens og ultrastruktur samtidigt6. Efter mEosEM blev flere fluorescerende proteiner, der kan overleve OsO4-farvningen og Epon-indlejringen, udviklet 8,9,10,11. Dette fremmer i høj grad udviklingen af CLEM.
Der er tre nøgleaspekter ved Epon efter indlejring af CLEM. Den første er det fluorescerende protein, som skal opretholde det fluorescerende signal efter forberedelse af EM-prøver. Ifølge vores erfaring er mScarlet bedre end andre rapporterede fluorescerende proteiner. Den anden er, hvordan man finder den samme celle afbildet af FM-billeddannelse i EM-billeddannelse. For at løse dette problem forbedrer vi proceduren for dette trin, så man let kan finde den målrettede celle. Den sidste er metoden til at justere FM-billedet med EM-billedet. Her beskriver vi registreringen mellem FM- og EM-billederne. I denne protokol udtrykker vi mScarlet i VGLUT2-neuroner og demonstrerer, at mScarlet kan målrette sekundære lysosomer ved hjælp af Epon post-embedding CLEM. Vi leverer trinvise detaljer til Epon efter indlejring af CLEM uden at gå på kompromis med fluorescensen og ultrastrukturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, er en alsidig billeddannelsesmetode, som kan kombinere lokaliseringsoplysningerne for målproteinet fra lysmikroskopi (LM) og konteksten omkring målproteinet fra elektronmikroskopi (EM)6. Med begrænsningerne ved nuværende fluorescerende proteiner er den udbredte metode præindlejring af korrelativt lys og elektronmikroskopi (CLEM), hvilket betyder, at LM-billeddannelsen udføres før EM-prøveforberedelsen. Næsten alle eksisterende fluorescerende proteiner ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32201235 til Zhifei Fu), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (2022J01287 til Zhifei Fu), Research Foundation for Advanced Talents ved Fujian Medical University, Kina (XRCZX2021013 til Zhifei Fu), Finance Special Science Foundation i Fujian-provinsen, Kina (22SCZZX002 til Zhifei Fu), Grundlæggelse af NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-Human Primate og Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 til Zhifei Fu). Vi takker Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin og Yan Hu på Public Technology Service Center, Fujian Medical University for støtte til EM-prøveforberedelse og EM-billeddannelse.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
