Epon पोस्ट एम्बेडिंग सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
Summary
हम एमस्कारलेट नामक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके एपॉन पोस्ट-एम्बेडिंग सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर को एक साथ बनाए रख सकती है। यह तकनीक विभिन्न प्रकार के जैविक अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी है।
Abstract
सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) एक व्यापक माइक्रोस्कोपी है जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एफएम) द्वारा प्रदान की गई स्थानीयकरण जानकारी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा अधिग्रहित सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के संदर्भ को जोड़ती है। CLEM प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर के बीच एक व्यापार-बंद है, और आमतौर पर, अल्ट्रास्ट्रक्चर प्रतिदीप्ति से समझौता करता है। ग्लाइसीडिल मेथैक्रिलेट, एचएम 20, या के 4 एम जैसे अन्य हाइड्रोफिलिक एम्बेडिंग रेजिन की तुलना में, एपॉन अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण और सेक्शनिंग गुणों में बेहतर है। पहले, हमने प्रदर्शित किया था कि एमईओएसईएम ऑस्मियम टेट्रोक्साइड निर्धारण और एपॉन एम्बेडिंग से बच सकता है। एमईओएसईएम का उपयोग करते हुए, हमने पहली बार, एपॉन पोस्ट एम्बेडिंग सीएलईएम हासिल किया, जो प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर को एक साथ बनाए रखता है। यहां, हम ईएम नमूना तैयार करने, एफएम इमेजिंग, ईएम इमेजिंग और छवि संरेखण के बारे में चरण-दर-चरण विवरण प्रदान करते हैं। हम ईएम इमेजिंग के दौरान एफएम इमेजिंग द्वारा इमेज किए गए एक ही सेल की पहचान करने के लिए प्रक्रियाओं में सुधार करते हैं और एफएम और ईएम छवियों के बीच पंजीकरण का विस्तार करते हैं। हमारा मानना है कि पारंपरिक ईएम सुविधाओं में इस नए प्रोटोकॉल के बाद सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को एम्बेड करने के बाद आसानी से एपॉन प्राप्त किया जा सकता है।
Introduction
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एफएम) स्थानीयकरण और लक्ष्य प्रोटीन के वितरण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, लक्ष्य प्रोटीन को घेरने वाला संदर्भ खो जाता है, जो लक्ष्य प्रोटीन की अच्छी तरह से जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) में उच्चतम इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन होता है, जो कई उपकोशिकीय विवरण प्रदान करता है। फिर भी, ईएम लक्ष्य लेबलिंग का अभाव है. ईएम द्वारा अधिग्रहित ग्रे छवि के साथ एफएम द्वारा ली गई प्रतिदीप्ति छवि को सही ढंग से विलय करके, सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) इन दो इमेजिंग मोड 1,2,3,4द्वारा प्राप्त जानकारी को जोड़ सकते हैं।
CLEM प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर1 के बीच एक व्यापार-बंद है। वर्तमान फ्लोरोसेंट प्रोटीन और पारंपरिक ईएम नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं की सीमाओं के कारण, विशेष रूप से ऑस्मिक एसिड (ओएसओ4) और हाइड्रोफोबिक रेजिन जैसे एपोन का उपयोग, अल्ट्रास्ट्रक्चर हमेशा प्रतिदीप्ति5 से समझौता करता है। ओएसओ4 ईएम नमूना तैयार करने में एक अनिवार्य अभिकर्मक है, जिसका उपयोग ईएम छवियों के विपरीत में सुधार करने के लिए किया जाता है। अन्य एम्बेडिंग रेजिन की तुलना में, एपॉन अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण और सेक्शनिंग गुणों में बेहतर है5. हालांकि, कोई फ्लोरोसेंट प्रोटीन ओएसओ4 और एपॉन एम्बेडिंग 6 के उपचार के बाद प्रतिदीप्ति संकेत को बनाए नहीं रख सकताहै। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सीमाओं को दूर करने के लिए, पूर्व एम्बेडिंग सीएलईएम विकसित किया गया था, जिसमें एफएम इमेजिंग ईएम नमूना तैयार करने से पहले किया जाता है6. हालांकि, पूर्व एम्बेडिंग CLEM का दोष एफएम औरEM छवियों 5 के बीच अभेद्य पंजीकरण है।
इसके विपरीत, पोस्ट एम्बेडिंग सीएलईएम विधि ईएम नमूना तैयार करने के बाद एफएम इमेजिंग करती है, जिसकी पंजीकरण सटीकता 6-7 एनएम 5,6 तक पहुंच सकती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रतिदीप्ति को बनाए रखने के लिए, OsO4 (0.001%)3 या उच्च दबाव जमे हुए (एचपीएफ) और फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस) ईएम तैयारी विधियों 4,7 की बहुत कम सांद्रता समझौता ultrastructure या ईएम छवि के विपरीत की कीमत पर इस्तेमाल किया गया है. mEos4b का विकास CLEM को एम्बेड करने के बाद की प्रगति को बहुत बढ़ावा देता है, हालांकि ग्लाइसीडिल मेथैक्रिलेट का उपयोग एम्बेडिंग राल5 के रूप में किया जाता है। एमईओएसईएम के विकास के साथ, जो ओएसओ4 धुंधला और एपॉन एम्बेडिंग से बच सकता है, एपॉन पोस्ट एम्बेडिंग सुपर-रिज़ॉल्यूशन सीएलईएम पहली बार हासिल किया गया था, प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर को एक साथ बनाए रखना6. एमईओएसईएम के बाद, कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन जो ओएसओ4 धुंधला और एपॉन एम्बेडिंग से बच सकते हैं, 8,9,10,11विकसित किए गए थे। यह CLEM के विकास को बहुत बढ़ावा देता है।
Epon पोस्ट-एम्बेडिंग CLEM के तीन प्रमुख पहलू हैं। पहला फ्लोरोसेंट प्रोटीन है, जो ईएम नमूना तैयार करने के बाद फ्लोरोसेंट सिग्नल को बनाए रखना चाहिए। हमारे अनुभव के अनुसार, mScarlet अन्य रिपोर्ट किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बेहतर है। दूसरा यह है कि ईएम इमेजिंग में एफएम इमेजिंग द्वारा इमेज किए गए एक ही सेल को कैसे खोजा जाए। इस समस्या को हल करने के लिए, हम इस चरण की प्रक्रिया में सुधार करते हैं ताकि कोई भी आसानी से लक्षित सेल को ढूंढ सके। अंतिम ईएम छवि के साथ एफएम छवि को संरेखित करने की विधि है। यहां, हम एफएम और ईएम छवियों के बीच पंजीकरण का विवरण देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम VGLUT2 न्यूरॉन्स में mScarlet व्यक्त करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि mScarlet Epon पोस्ट-एम्बेडिंग CLEM का उपयोग करके माध्यमिक लाइसोसोम को लक्षित कर सकता है। हम प्रतिदीप्ति और अल्ट्रास्ट्रक्चर से समझौता किए बिना, एपॉन पोस्ट-एम्बेडिंग सीएलईएम के लिए चरण-दर-चरण विवरण प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक बहुमुखी इमेजिंग विधि है, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एलएम) से लक्ष्य प्रोटीन की स्थानीयकरण जानकारी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)6से लक्ष्य प्रोटीन के आसपास के सं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32201235 से झिफेई फू), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन का नेचुरल साइंस फाउंडेशन (2022J01287 से ज़िफ़ेई फ़ू), फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी, चीन में एडवांस्ड टैलेंट के लिए रिसर्च फाउंडेशन (झिफ़ेई फू के XRCZX2021013), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन के फाइनेंस स्पेशल साइंस फाउंडेशन (22SCZZX002 से ज़िफ़ेई फू) द्वारा समर्थित किया गया था, गैर-मानव प्राइमेट के लिए प्रजनन विनियमन के तकनीकी मूल्यांकन की एनएचसी प्रमुख प्रयोगशाला की नींव, और फ़ुज़ियान मातृत्व और बाल स्वास्थ्य अस्पताल (2022-एनएचपी-04 से ज़िफ़ेई फू)। हम ईएम नमूना तैयार करने और ईएम इमेजिंग के साथ समर्थन के लिए सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में लिनिंग झोउ, मिनक्सिया वू, शी लिन और यान हू को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
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