Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
Summary
우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.
Abstract
상관 광 및 전자 현미경(CLEM)은 형광 현미경(FM)이 제공하는 국소화 정보와 전자 현미경(EM)으로 획득한 세포 초미세 구조의 맥락을 결합한 포괄적인 현미경입니다. CLEM은 형광과 미세구조 사이의 절충안이며, 일반적으로 초미세구조는 형광을 손상시킵니다. 글리시딜 메타크릴레이트, HM20 또는 K4M과 같은 다른 친수성 임베딩 수지와 비교할 때 Epon은 미세구조 보존 및 절편 특성이 우수합니다. 이전에 우리는 mEosEM이 오스뮴 사산화물 고정 및 에폰 임베딩에서 살아남을 수 있음을 입증했습니다. mEosEM을 사용하여 형광과 초미세 구조를 동시에 유지하는 Epon 포스트 임베딩 CLEM을 처음으로 달성했습니다. 여기에서는 EM 샘플 준비, FM 이미징, EM 이미징 및 이미지 정렬에 대한 단계별 세부 정보를 제공합니다. 또한 EM 이미징 중에 FM 이미징으로 이미징된 동일한 세포를 식별하는 절차를 개선하고 FM과 EM 이미지 간의 정합을 자세히 설명합니다. 우리는 전통적인 EM 시설에서 이 새로운 프로토콜에 따라 상관 광 및 전자 현미경을 포함하는 Epon 포스트 임베딩을 쉽게 달성할 수 있다고 믿습니다.
Introduction
형광 현미경(FM)을 사용하여 표적 단백질의 국소화 및 분포를 얻을 수 있습니다. 그러나 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트가 손실되며, 이는 표적 단백질을 철저히 조사하는 데 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 이미징 해상도가 가장 높아 여러 세포 내 세부 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 EM에는 표적 라벨링이 없습니다. FM으로 촬영한 형광 이미지를 EM으로 획득한 회색 이미지와 정확하게 병합함으로써 상관광 및 전자 현미경(CLEM)은 이 두 가지 이미징 모드 1,2,3,4에서 얻은 정보를 결합할 수 있습니다.
CLEM은 형광과 초미세구조1 사이의 절충안이다. 현재 형광 단백질과 기존 EM 시료 전처리 절차의 한계, 특히 오스믹산(OsO4) 및 Epon과 같은 소수성 수지의 사용으로 인해 미세구조는 항상 형광5를 손상시킵니다. OsO4 는 EM 시료 전처리에 없어서는 안 될 시약으로, EM 이미지의 대비를 개선하는 데 사용됩니다. 다른 끼워넣는 수지와 비교해, EPON는 ultrastructure 보전과 단면도 재산에서 우량합니다5. 그러나 형광 단백질은 OsO4 및 Epon embedding6 처리 후 형광 신호를 유지할 수 없습니다. 형광 단백질의 한계를 극복하기 위해 EM 시료 전처리 전에 FM 이미징을 수행하는 사전 임베딩 CLEM이 개발되었습니다6. 그러나 CLEM을 사전 임베딩하는 것의 단점은 FM과 EM 이미지 간의 부정확한 등록이다5.
반대로, 포스트 임베딩 CLEM 방법은 EM 샘플 준비 후 FM 이미징을 수행하며, 그 등록 정확도는 6-7nm 5,6에 도달 할 수 있습니다. 형광 단백질의 형광을 유지하기 위해 매우 낮은 농도의 OsO4 (0.001 %)3 또는 고압 동결 (HPF) 및 동결 치환 (FS) EM 제조 방법 4,7이 사용되어 미세 구조 손상 또는 EM 이미지의 대비를 희생했습니다. mEos4b의 개발은 임베딩 수지5로 글리시딜 메타크릴레이트가 사용되지만, 포스트 임베딩 CLEM의 진행을 크게 촉진한다. OsO4 염색 및 Epon 임베딩에서 살아남을 수 있는 mEosEM의 개발로 Epon 포스트 임베딩 초고해상도 CLEM이 처음으로 달성되어 형광과 미세구조를 동시에 유지했습니다6. mEosEM 후, OsO4 염색 및 Epon 임베딩에서 살아남을 수 있는 여러 형광 단백질이 개발되었습니다 8,9,10,11. 이것은 CLEM의 개발을 크게 촉진합니다.
Epon 포스트 임베딩 CLEM에는 세 가지 주요 측면이 있습니다. 첫 번째는 형광 단백질로, EM 시료 전처리 후 형광 신호를 유지해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, mScarlet은 보고된 다른 형광 단백질보다 우수합니다. 두 번째는 EM 이미징에서 FM 이미징으로 이미징된 동일한 세포를 찾는 방법입니다. 이 문제를 해결하기 위해 표적 세포를 쉽게 찾을 수 있도록 이 단계의 절차를 개선합니다. 마지막은 FM 이미지를 EM 이미지와 정렬하는 방법입니다. 여기에서는 FM과 EM 이미지 간의 정합에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서는 VGLUT2 뉴런에서 mScarlet을 발현하고 mScarlet이 Epon post-embedding CLEM을 사용하여 2차 리소좀을 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. 형광 및 미세 구조를 손상시키지 않고 Epon 포스트 임베딩 CLEM에 대한 단계별 세부 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 광학 현미경(LM)에서 얻은 표적 단백질의 국소화 정보와 전자 현미경(EM)에서 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트를 결합할 수 있는 다목적 이미징 방법입니다6. 현재 형광 단백질의 한계로 인해 널리 사용되는 방법은 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)을 사전 임베딩하는 것인데, 이는 EM 시료 전처리 전에 LM 이미징이 수행됨을 의미합니다. 거의 모든 기존 형광 단…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단 (32201235 to Zhifei Fu), 중국 푸젠 성 자연 과학 재단 (2022J01287 to Zhifei Fu), 중국 푸젠 의과 대학 고급 인재 연구 재단 (XRCZX2021013 Zhifei Fu), 중국 푸젠 성 금융 특수 과학 재단 (22SCZZX002 to Zhifei Fu), 비인간 영장류에 대한 생식력 조절 기술 평가의 NHC 핵심 연구소 및 푸젠 산부인과 및 아동 건강 병원 설립(2022-NHP-04 to Zhifei Fu). EM 샘플 준비 및 EM 이미징을 지원해 주신 Fujian Medical University 공공 기술 서비스 센터의 Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin, Yan Hu에게 감사드립니다.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
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