Epon Post Embedding korrelativ lys og elektronmikroskopi
Summary
Vi presenterer en detaljert protokoll for Epon post-embedding korrelativ lys og elektronmikroskopi ved bruk av et fluorescerende protein kalt mScarlet. Denne metoden kan opprettholde fluorescensen og ultrastrukturen samtidig. Denne teknikken er egnet til et bredt spekter av biologiske applikasjoner.
Abstract
Korrelativ lys og elektronmikroskopi (CLEM) er en omfattende mikroskopi som kombinerer lokaliseringsinformasjonen fra fluorescensmikroskopi (FM) og konteksten av cellulær ultrastruktur oppnådd ved elektronmikroskopi (EM). CLEM er en avveining mellom fluorescens og ultrastruktur, og vanligvis kompromitterer ultrastruktur fluorescens. Sammenlignet med andre hydrofile innebyggingsharpikser, som glycidylmetakrylat, HM20 eller K4M, er Epon overlegen i ultrastrukturbevaring og seksjoneringsegenskaper. Tidligere hadde vi vist at mEosEM kan overleve osmiumtetroxidfiksering og Epon-innebygging. Ved å bruke mEosEM oppnådde vi for første gang Epon post embedding CLEM, som opprettholder fluorescensen og ultrastrukturen samtidig. Her gir vi trinnvise detaljer om EM-prøveprepareringen, FM-avbildningen, EM-avbildningen og bildejusteringen. Vi forbedrer også prosedyrene for å identifisere den samme cellen avbildet av FM-avbildning under EM-avbildningen og detaljerer registreringen mellom FM- og EM-bildene. Vi tror man enkelt kan oppnå Epon etter innebygging av korrelativ lys og elektronmikroskopi etter denne nye protokollen i tradisjonelle EM-anlegg.
Introduction
Fluorescensmikroskopi (FM) kan brukes til å oppnå lokalisering og distribusjon av målproteinet. Imidlertid går konteksten som omgir målproteinet tapt, noe som er avgjørende for å undersøke målproteinet grundig. Elektronmikroskopi (EM) har den høyeste bildeoppløsningen, og gir flere subcellulære detaljer. Likevel mangler EM målmerking. Ved nøyaktig sammenslåing av fluorescensbildet tatt av FM med det grå bildet som er oppnådd av EM, kan korrelativ lys og elektronmikroskopi (CLEM) kombinere informasjonen oppnådd av disse to bildemodusene 1,2,3,4.
CLEM er en avveining mellom fluorescens og ultrastruktur1. På grunn av begrensningene i dagens fluorescerende proteiner og de tradisjonelle EM-prøveprepareringsprosedyrene, spesielt bruk av osminsyre (OsO4) og hydrofobe harpikser som Epon, kompromitterer ultrastrukturen alltid fluorescens5. OsO4 er et uunnværlig reagens i EM-prøvepreparering, som brukes til å forbedre kontrasten til EM-bilder. Sammenlignet med andre innebyggingsharpikser er Epon overlegen i ultrastrukturbevaring og seksjoneringsegenskaper5. Imidlertid kan ingen fluorescerende proteiner beholde fluorescenssignalet etter behandling av OsO4 og Epon innebygging6. For å overvinne begrensningene til fluorescerende proteiner ble det utviklet pre-embedding CLEM, hvor FM-avbildning gjøres før EM-prøvepreparering6. Ulempen med forhåndsinnbygging av CLEM er imidlertid den upresise registreringen mellom FM- og EM-bildene5.
Tvert imot, etter innebygging av CLEM-metoden utfører FM-avbildningen etter EM-prøveprepareringen, hvis registreringsnøyaktighet kan nå 6-7 nm 5,6. For å beholde fluorescensen av fluorescerende proteiner, har svært lave konsentrasjoner av OsO4 (0,001%)3 eller høytrykksfrosset (HPF) og frysesubstitusjon (FS) EM-forberedelsesmetoder 4,7 blitt brukt på bekostning av kompromittert ultrastruktur eller kontrasten til EM-bildet. Utviklingen av mEos4b fremmer i stor grad fremdriften etter innebygging av CLEM, selv om glycidylmetakrylat brukes som innebygging av harpiks5. Med utviklingen av mEosEM, som kan overleve OsO4-farging og Epon-innebygging, ble Epon etter innebygging av superoppløsning CLEM oppnådd for første gang, og opprettholdt fluorescens og ultrastruktur samtidig6. Etter mEosEM ble flere fluorescerende proteiner som kan overleve OsO 4-fargingen og Epon-innebyggingen utviklet 8,9,10,11. Dette fremmer i stor grad utviklingen av CLEM.
Det er tre viktige aspekter ved Epon post-embedding CLEM. Den første er det fluorescerende proteinet, som skal opprettholde det fluorescerende signalet etter EM-prøvepreparering. Ifølge vår erfaring er mScarlet overlegen andre rapporterte fluorescerende proteiner. Den andre er hvordan du finner den samme cellen avbildet av FM-avbildning i EM-bildebehandling. For å løse dette problemet forbedrer vi prosedyren for dette trinnet slik at man lett kan finne den målrettede cellen. Den siste er metoden for å justere FM-bildet med EM-bildet. Her beskriver vi registreringen mellom FM- og EM-bildene. I denne protokollen uttrykker vi mScarlet i VGLUT2-nevroner og demonstrerer at mScarlet kan målrette sekundære lysosomer ved bruk av Epon post-embedding CLEM. Vi gir trinnvise detaljer for Epon etter innebygging av CLEM, uten at det går ut over fluorescensen og ultrastrukturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her er en allsidig avbildningsmetode, som kan kombinere lokaliseringsinformasjonen til målproteinet fra lysmikroskopi (LM) og konteksten rundt målproteinet fra elektronmikroskopi (EM) 6. Med begrensningene til nåværende fluorescerende proteiner, er den mye brukte metoden pre-embedding korrelativ lys og elektronmikroskopi (CLEM), noe som betyr at LM-avbildningen gjøres før EM-prøveprepareringen. Nesten alle eksisterende fluorescerende proteiner kan undersøkes i p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (32201235 til Zhifei Fu), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (2022J01287 til Zhifei Fu), Research Foundation for Advanced Talents ved Fujian Medical University, Kina (XRCZX2021013 til Zhifei Fu), Finance Special Science Foundation of Fujian Province, Kina (22SCZZX002 til Zhifei Fu), Stiftelsen av NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, og Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 til Zhifei Fu). Vi takker Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin og Yan Hu ved Public Technology Service Center, Fujian Medical University for støtte med EM-prøveforberedelse og EM-bildebehandling.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
