3D-utskrift på mikrometerskala möjliggör snabb prototypframställning av polymera enheter för neuronala cellkulturer. Som ett principbevis begränsades strukturella kopplingar mellan neuroner genom att skapa barriärer och kanaler som påverkade neuritutväxt, medan de funktionella konsekvenserna av sådan manipulation observerades av extracellulär elektrofysiologi.
Neuronala kulturer har varit en experimentell referensmodell i flera decennier. 3D-cellarrangemang, rumsliga begränsningar för neuritutväxt och realistisk synaptisk konnektivitet saknas dock. Det senare begränsar studiet av struktur och funktion i samband med kompartmentalisering och minskar betydelsen av kulturer inom neurovetenskapen. Att approximera ex vivo det strukturerade anatomiska arrangemanget av synaptisk konnektivitet är inte trivialt, trots att det är nyckeln till uppkomsten av rytmer, synaptisk plasticitet och i slutändan hjärnans patofysiologi. Här används tvåfotonpolymerisation (2PP) som en 3D-utskriftsteknik, vilket möjliggör snabb tillverkning av polymera cellodlingsenheter med polydimetyl-siloxan (PDMS) i mikrometerskala. Jämfört med konventionella replikformningstekniker baserade på mikrofotolitografi möjliggör 2PP-utskrift i mikroskala snabb och prisvärd vändning av prototyper. Detta protokoll illustrerar design och tillverkning av PDMS-baserade mikrofluidiska enheter som syftar till att odla modulära neuronala nätverk. Som ett principbevis presenteras en tvåkammarenhet för att fysiskt begränsa anslutningen. Specifikt gynnas en asymmetrisk axonal utväxt under ex vivo-utveckling och tillåts ledas från en kammare till en annan. För att undersöka de funktionella konsekvenserna av enkelriktade synaptiska interaktioner väljs kommersiella mikroelektrodarrayer för att övervaka den bioelektriska aktiviteten hos sammankopplade neuronala moduler. Här illustreras metoder för att 1) tillverka formar med mikrometerprecision och 2) utföra in vitro extracellulära registreringar på flera platser i kortikala neuronala kulturer hos råtta. Genom att minska kostnaderna och den framtida utbredda tillgängligheten av 2PP 3D-utskrifter kommer denna metod att bli mer och mer relevant i forskningslaboratorier över hela världen. Speciellt inom neuroteknik och neural dataregistrering med hög genomströmning kommer enkelheten och snabbheten i prototyper förenklade in vitro-modeller att förbättra experimentell kontroll och teoretisk förståelse av storskaliga neurala system in vivo .
Att undersöka neuronal aktivitet i organismer som beter sig innebär flera utmaningar. Till exempel begränsas den fysiska tillgången till hjärnvävnaden av behovet av att upprätthålla dess integritet, så hjärnans ytliga regioner är lättare att ta hänsyn till. Att isolera specifika mål i den intakta vävnaden är ofta en skrämmande uppgift och ibland omöjligt. Även om dissocierade homogena neuronala kulturer erbjuder bekväm tillgång till de molekylära, biokemiska och biofysiska egenskaperna hos enskilda (sub)cellulära komponenter i en neural krets, går en realistisk konnektivitet och anatomisk organisation av den intakta hjärnan förlorad. Dessa grundläggande begränsningar inspirerade forskningsinsatser för att uppnå en medelväg, där in vivo-komplexitet undviks medan strukturen kan konstrueras in vitro, vilket är på begäran 1,2,3,4,5,6,7,8,9. I synnerhet har modulära neuronala kulturer varit föremål för omfattande forskning under de senaste decennierna, som syftar till att ta itu med nyckelfrågor inom hjärnans fysiologi som beskrivs nedan.
Organisation: In vivo-studier visar att hjärnan är anatomiskt uppbyggd i lager med exakta celltyper och matriser av projektioner. Funktionella analyser avslöjade organisationen av de neuronala nätverken i nodsammansättningar och moduler, med exakta anslutningsscheman10,11. Konnektivitets- och mikrokretsmotivens roll kan dock inte studeras tillräckligt in vivo på grund av det stora antalet synapser som är inblandade, liksom de sammanvävda effekterna av utveckling och aktivitetsberoende plasticitet.
Signalöverföring: I in vivo – eller slumpmässiga in vitro-odlingar är det svårt att bedöma signalöverföringen. Att undersöka axonal lednings- och aktionspotential längs dess längd kräver att man vägleder neuritutväxten genom ytfunktionalisering eller kemisk mönstring, vilket ger ett högt signal-brusförhållande i extracellulära avläsningar av elektrisk aktivitet12.
Translationell relevans: Att dechiffrera den exklusiva rollen för pre- kontra postsynaptiska element över patologiska tillstånd kräver att man har tillgång till dessa element individuellt. Modulära kulturer med begränsad konnektivitet, som effektivt separerar de pre- och postsynaptiska elementen, är oumbärliga verktyg för detta ändamål13.
Det finns flera metoder för att få någon form av struktur i neuronal odling. De kan i stort sett kategoriseras som kemisk och fysisk ytmanipulation9. De förstnämnda metoderna14,15 bygger på neuronala cellers benägenhet att binda till vissa (bio)kemiska föreningar. Detta kräver att man deponerar lim eller attraktiva molekyler på en yta med mikroskala precision och följer ett detaljerat mönster. Även om detta möjliggör en partiell täckning av cellernas yta, enligt det önskade mönstret, är kemiska metoder till sin natur begränsade och har en relativt låg framgångsfrekvens i neurittillväxtvägledning16. Full kontroll över axonriktningen kräver att man upprättar en rumslig gradient av ad-hoc-kemikalier för att forma axonal vägledning17. De senare metoderna involverar fysisk ytmanipulation och används oftare för att strukturera de neuronala nätverken in vitro. Neuronala celler är fysiskt begränsade på önskade platser av geometriska inneslutningar, såsom mikroskopiska kammare, väggar, kanaler, etc., vilket formar en biokompatibel polymer såsom polydimetylsiloxan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 härdad och stelnad till en mikrofluidisk anordning. De facto-metoden för PDMS-mikrofluidisk tillverkning är mjuk fotolitografi21, där en tvådimensionell mask mönstras i mikroskala och används för att selektivt etsa ett kiselbaserat material vid UV-exponering. I ett nötskal beläggs ett UV-härdbart harts (dvs. fotoresist) på en kiselskiva genom spinnbeläggning och når en specifik höjd som bestäms av dess viskositet och centrifugeringshastighet. Sedan placeras den mönstrade masken över fotoresisten och utsätts för UV-ljus. Genomskinliga områden i masken, som motsvarar intressanta områden, låter UV-ljus inducera lokaliserad tvärbindning av fotoresistmolekylerna. Områdena med oexponerad fotoresist tvättas bort med ett lösningsmedel, vilket resulterar i bildandet av en masterform. Detta används upprepade gånger för att baka en valfri elastomer (dvs. PDMS), som sedan graveras med önskade geometrier i så många kopior som önskas. En sådan tillverkningsmetod är den vanligaste metoden för att tillverka mikrofluidiska enheter22. De kanske största begränsningarna med mjuk fotolitografi är förutsättningen för anmärkningsvärda kapitalinvesteringar och de biologiska laboratoriernas okunskap om de tekniker och den expertis som krävs. Beredningen av masken och de steg i mjuk fotolitografi som krävs för att designa komplexa geometrier med flera höjder och högt bildförhållande är icke-triviala23 och kräver ofta outsourcing. Även om alternativa metoder och lågbudgetmetoder har föreslagits, uppfyller de inte alltid de krav på hög precision som ställs vid biologisk prototypframställning24.
Här presenteras en alternativ tillverkningsmetod som bygger på tvåfotonpolymerisation (2PP) och additiv tillverkning. Det är enkelt och kräver i sig ingen avancerad expertis inom mikrofabrikation och mikrofotolitografi. Forskningsområdet 2PP mikrotillverkning uppstod i slutet av 90-talet25, och sedan dess har det bevittnat exponentiell tillväxt26. Mer om de grundläggande principerna för denna teknik finns på annan plats26. Kortfattat, genom att fokusera excitationsljusimpulsen i det tredimensionella rummet, utnyttjar 2PP det icke-linjära beroendet av multifotonabsorption på intensitet. Detta ger möjlighet till begränsad absorption, vilket säkerställer exakt och selektiv excitation inom mycket lokala regioner. I huvudsak utsätts en fotoresist med negativ ton, ett material med minskad löslighet vid ljusexponering, för en fokuserad stråle av femtosekundlaserpulser vid en låg arbetscykel27. Detta möjliggör impulser med hög intensitet vid låga medeleffekter, vilket möjliggör polymerisation utan att skada materialet. Interaktionen mellan fotoinducerade radikalmonomerer ger upphov till radikaloligomerer, som initierar polymerisation som sträcker sig genom fotoresisten upp till en distinkt volym, dvs voxel, vars storlek beror på intensiteten och varaktigheten av laserpulserna28.
I detta arbete presenteras två komponenter: A) design och snabb tillverkning av en 3D-printad form, som kan återanvändas många gånger för att producera engångspolymera neuronala cellodlingsenheter (Figur 1), och B) deras mekaniska koppling på ytan av plana neuronala cellodlingssubstrat, eller till och med av substratintegrerade mikroelektrodmatriser som kan spela in bioelektriska signaler på flera platser.
Datorstödd design av en mekanisk 3D-modell beskrivs mycket kortfattat här och tillsammans med stegen som leder till en 3D-printad form och tillverkning av PDMS-enheter beskrivs också i detalj.
En mängd olika datorstödda designprogram kan användas för att generera den startande 3D-objektmodellen och producera en STL-fil för att styra 2PP-utskriftsprocessen. I materialtabellen är de första och sista applikationerna som listas gratis eller försedda med en gratis licens. Att konstruera en 3D-modell kräver alltid att man skapar en 2D-skiss, som sedan extruderas i efterföljande modelleringssteg. För att demonstrera detta koncept lyfts en generisk 3D CAD-programvarudesignprocess fram i protokollavsnittet, vilket leder till en struktur gjord av överlappande kuber. För mer omfattande information finns ett antal onlinehandledningar och kostnadsfria utbildningsresurser tillgängliga, som anges i materialförteckningen.
Den resulterande STL-filen översätts sedan till en serie kommandon som ska utföras av 3D-skrivaren (dvs. skivningsprocedur). För den specifika 2PP 3D-skrivaren som används används programvaran DeScribe för att importera STL-filen och konvertera den till det proprietära formatet General Writing Language (GWL). Framgången för 2PP-utskriftsprocessen beror på olika parametrar, särskilt laserkraft och dess skanningshastighet, sömnad och kläcknings-skivningsavstånd. Valet av dessa parametrar, tillsammans med valet av objektiv och fotoresist, beror på designens minsta egenskaper, såväl som den avsedda applikationen. Således blir parameteroptimering avgörande för att uppfylla kraven i olika designscenarier och användningsfall. För detta arbete har det rekommenderade receptet IP-S 25x ITO Shell (3D MF) övervägts som en konfiguration för utskriftsparametrarna. I slutändan skrivs en mekaniskt stabil tryckt del ut med den nödvändiga upplösningen samtidigt som 3D-utskriftstiden minimeras.
Formdesignen och den relaterade STL-filen, som demonstreras i detta arbete, består av en kvadratisk ram för att separera utrymmet för en cellkultur i två fack: ett yttre område (dvs. kallat Source senare) och ett inre område (dvs. kallat Target senare). Dessa två fack är sammankopplade genom uppsättningar av mikrokanaler, var och en kännetecknad av skarpa vinkelkanter, utformade för att specifikt hindra tillväxten av neuriter från målet till källan, men inte vice versa, och som sådan främja en riktad synaptisk anslutning mellan neuroner som växer på de två områdena.
Tidigare studier använde olika geometrier av mikrokanaler för att uppmuntra riktad tillväxt av neuriter. Exempel är triangulära former18, kanaltaggiga strukturer19 och avsmalnande kanaler20. Här används en design med skarpa vinkelbarriärer över mikrokanalens gränser, som också kännetecknas av asymmetriska ingångar. Dessa mikrokanaler tjänar till att skapa kontinuitet mellan en sluten inre, målfacket, och det yttre området, källfacket. Trattformen på den första delen av mikrokanalerna, från källsidan, är utformad för att främja bildandet av axonala buntar och deras tillväxt längs den kortaste, dvs. raka linjen, vägen som förbinder källan med målet. Det triangulära rummet som realiseras genom att vända skarpa vinklar har större volym på målsidan för att effektivt fördröja neuriternas vägfinnande samtidigt som det gynnar snabb fotografering av buntar som härrör från källan och ockupation av det tillgängliga utrymmet. Valet av 540 μm för mikrokanalernas längd filtrerar effektivt bort den generellt kortare dendritiska utväxten39. Dessutom hindrar deras höjd på 5 μm cellsomata från att tränga igenom mikrokanalerna. Sammantaget visade sig den här konfigurationen främja enkelriktad anslutning mellan de yttre modulerna, Source och inre Target-modulerna, och den presenteras här som ett principbevis bland de många alternativa alternativen.
Medan PDMS-enheterna, tillverkade av 2PP-formen, kan fästas på ytan av vanliga cellodlingssubstrat, såsom glastäcken eller petriskålar, användes i detta arbete kommersiellt tillgängliga substratintegrerade mikroelektrodmatriser. Inga ansträngningar har gjorts för att optimera 3D-designen till mikroelektrodmatrisens layout, och den mekaniska kopplingen utfördes under stereomikroskopivägledning som endast syftade till att placera enheten över arrayen, vilket lämnade en del mikroelektrod avtäckt på båda sidor, källan och målet. Detta möjliggör en preliminär bedömning av de funktionella konsekvenserna av den begränsade konnektiviteten i neuronala cellkulturer.
Trots att den är decennier gammal är tillämpningen av 2PP-teknik i PDMS-baserad replikgjutning i mikrometerskala en ny utveckling43,44. I detta sammanhang diskuteras en rad punkter nedan för att hjälpa användare att effektivt reproducera detta verk.
För 3D-modelldesign, se till att modellen inte har hål eller självskärningar. Privilegium för det binära filformatet när du sparar som STL, för dess mindre filstorlek än ASCII-kodad. Detta är särskilt fördelaktigt för konstruktioner med intrikata geometrier och för milliliterbreda objekt. Att använda binära STL-filer innebär också låg CPU-belastning, vilket senare i processen förbereder den mekaniska delen för att 3d-printas. Funktionernas fysiska dimensioner i STL-filen representeras i dimensionslösa enheter. Under efterbearbetningen av STL-filen tolkas enheter som mikrometrar. Därför rekommenderas det att i förväg använda den intressanta enheten, dvs. mikrometern, när du förbereder filen. Noggrannheten hos den tryckta modellen bestäms av antalet ytor som approximerar tessellerade trianglar. För ett otillräckligt antal ytor kommer oönskad ytjämnhet att uppstå. Att sikta på alltför hög noggrannhet med ett mycket stort antal ytor kommer dock till priset av en hög beräkningsbelastning, vilket gör att filbearbetningen blir långsam.
För 3D-utskrift, under utskrift, bildas det fysiska 3D-objektet med hjälp av snabb galvo-skanning i x-y-planet och piezorörelse i z-riktningen. Detta fokuserar femtosekundlaserstrålen i en given 3D-voxel. Men när utskriftsstrukturerna är större än galvos och piezos rumsliga täckningsområden måste objektet delas upp programmatiskt i block. Även om detta är ett krav för millimeterstora tryckta delar, är korsningar mellan block associerade med (ofullständiga) sömnadslinjer. Noggrann optimering av antalet block och placering av sammanfogningslinjer i x-, y- och z-riktningarna är avgörande för att undvika att störa kritiska geometriska egenskaper hos det slutliga objektet med sammanfogningslinjer. Bubblor kan bildas vid tryckgränssnittet av olika anledningar (t.ex. substrat, fotoresistens föroreningar och inhomogeniteter) och negativt påverka kvaliteten och integriteten hos den tryckta strukturen. Dessutom kan högre lasereffekt leda till en ökning av deras förekomst. Att minska lasereffekten, vid det lägsta lagret av den tryckta delen, kommer att minimera risken för bubbelbildning. Som ett alternativ till att skriva ut hela delen som en solid struktur kan skal- och ställningsmetoden övervägas. Det innebär att endast den yttre ytan av delen (skalet) skrivs ut samt triangulära prismaelement i den. Dessa element är separerade av horisontella lager (byggnadsställningar), som håller det opolymeriserade hartset i små fickor. Denna metod förkortar utskriftstiden avsevärt, vilket är särskilt relevant för millimeterstora strukturer. Men eftersom icke-polymeriserat harts finns kvar, är UV-exponering efter tryckning absolut nödvändig för att säkerställa full mekanisk stabilitet, även om detta steg måste utföras försiktigt för att undvika deformation av den tryckta delen. Efterhärdningstiden beror på valet av harts, delens tjocklek och UV-effekt40. För optimala resultat rekommenderas att genomföra ett första försök för att uppskatta den tid som behövs för härdning på fullt djup, med hjälp av en droppe fotoresist och utvärdera dess snittskärning efter UV-exponering. Den vanliga härdningsperioden varierar mellan 5 och 20 minuter.
För PDMS-replikgjutning kan det vara en utmaning att tillverka en PDMS-enhet med mikrometerskala, utan renrumsanläggningar: luftburna mikropartiklar kan finnas på PDMS-systemets mycket vidhäftande yta och hindra tätningen mellan enheten och substratet, eller blockera sektionen av enskilda mikrokanaler. Att utföra protokollstegen under en huv med laminärt flöde och konsekvent avskärma PDMS-ytan med isopropanol minimerar kontamineringsriskerna avsevärt. Härdningstemperaturen och dess varaktighet påverkar direkt PDMS-tvärbindningen och de resulterande fysikaliska egenskaperna. I synnerhet är vidhäftningsförmågan hos härdad PDMS en kritisk faktor. Å ena sidan krävs en tät tätning mellan PDMS-enheten och ytan som används för neuronal cellodling (t.ex. ett glasglas eller en MEA), för att effektivt begränsa passagen av neuriterna. Å andra sidan bör PDMS-enheten fästas på ytan reversibelt, så att det ömtåliga isolerande skiktet MEA inte skadas efter att enheten tagits bort. Även om PDMS-krympning under härdning sker och kan korrigeras genom att skala om formen i förväg, kommer krympningen för temperaturer och härdningsintervall som anges här att vara mindre än 2 %42 och kommer inte att påverka signifikant, enskiktiga PDMS-enheter. Sammantaget, följ exakt de rekommenderade härdningstemperatur- och varaktighetsvärdena för bästa resultat.
Översikt över metodens fördelar och begränsningar
En teknik baserad på direkt laserskrivning med 2 foton föreslås för snabb tillverkning av polymera enheter i mikroskala för experimentella studier av modulära neurala nätverk. Till skillnad från mjuk fotolitografi kräver det föreslagna tillvägagångssättet inte en hög nivå av teknisk expertis, förutsatt att en funktionell 2PP 3D-utskriftsinstallation är tillgänglig och operativ. Anmärkningsvärt nog gör metoden det möjligt att gå från en CAD-designad 3D-modell till en funktionell PDMS-enhet på en enda dag, vilket ger en direkt och effektiv väg från koncept till konkret förverkligande. Att välja utskriftsläget för skal och ställning minskar avsevärt den tid som krävs för att skapa formen, eftersom endast en bråkdel av dess volym skrivs ut. Efterföljande UV-härdning av den tryckta komponenten garanterar dess mekaniska stabilitet och robusthet, vilket verifieras här över 50 gjutningscykler med PDMS.
Jämfört med traditionella metoder har 2PP 3D-utskrift en klar fördel, som är mest uttalad när det gäller tillverkning av formar med ett betydande bildförhållande, krävande upplösningskrav och komplexa tredimensionella geometrier. Produktionen av masterformar med hjälp av standard UV-litografi begränsas av en resisttjocklek på cirka 200 μm. Intrikata sekvenser av spinnbeläggnings- och exponeringscykler35, kostsamma LIGA (litografi, galvanisering och gjutning) eller djupa reaktiva jonetsningsprocesser (DRIE)36 krävs för att uppnå större höjd- och bildförhållanden. I skarp kontrast, som demonstrerades i det banbrytande arbetet av Kumi et al. 201037, erbjuder 2PP-tekniken ett i princip obegränsat utrymme för bildförhållandet för de tryckta delarna, som sträcker sig från submikrometer till millimeter. Här har mikrotillverkningsprocessen för en form med betydande skillnad i höjd på dess delar exemplifierats, med en över 100-faldig skillnad mellan mikrokanalernas höjd (5 μm och den maximala formens höjd (545 μm; se figur 2).
Dessutom kan submikrometerupplösning lätt uppnås genom att följa de protokollspecifikationer som beskrivs. Som jämförelse kräver det kapitalinvesteringar för att uppnå förbättrade mögelupplösningar genom UV-fotolitografi. Maskerna med den finaste upplösningen, som använder kromdeposition på kvarts med en nominell upplösning på 600 nm, är prissatta flera storleksordningar högre än de lasertryckta OH-maskerna, som har en upplösning på 250 μm35, se dock arbetet av Pirlo et al.41. För att vara lönsam för internt bruk måste en vald metod vara kostnadseffektiv. För många biologiska laboratorier utgör den totala kostnaden i samband med konventionell mjuk fotolitografi eller direkt laserskrivning ett hinder. Även om det är möjligt att göra båda teknikerna mer tillgängliga genom att köpa och montera de väsentliga komponenterna, kräver detta tillvägagångssätt ytterligare expertis och kräver fortfarande en betydande investering. I detta sammanhang är en viktig punkt att tänka på det bredare spektrumet av tillämpningar som kan uppnås genom direkt laserskrivning. Till skillnad från konventionell mjuk fotolitografi, som främst är begränsad till mikrotillverkning av formar, uppvisar 2PP 3D-utskrift en anmärkningsvärd mångsidighet. Dess potentiella tillämpningar sträcker sig från mikrofluidik och mikrooptik till integrerad fotonik och mikromekanik. Detta gör det tilltalande att investera i denna teknik som en gemensam anläggning för flera och olika vetenskapliga områden. Till exempel är den 2PP-baserade metodiken som utarbetats i detta protokoll resultatet av ett tvärvetenskapligt samarbete mellan neurovetenskapliga och matematiska avdelningar inom vår institution. Dessutom är fotoresistutvecklingen ett aktivt forskningsområde och kan potentiellt utöka användningsområdet för 2PP 3D-utskrift. Ett exempel på detta är den nyligen introducerade IP-PDMS-hartsen. Genom att polymerisera till strukturer med egenskaper som PDMS38 låser detta harts upp potentialen för direkt mikrofabrikation av biokompatibla komponenter som har invecklad yta eller innehåller ihåliga utrymmen. Dessa krångligheter står som hinder för att uppnå liknande resultat genom konventionella replikgjutningsprocedurer.
Som en demonstration av denna metod tillhandahölls bevis som tyder på utvecklingen av enkelriktad konnektivitet mellan två moduler i ett modulärt neuronalt nätverk. Mikroskaleformen, tillverkad med 2PP-teknik, hade tillräckligt med uthållighet för att genomgå flera PDMS-gjutningar och har den nödvändiga precisionen i mikroskala. Sammanfattningsvis kan sägas att tillämpningsområdet för det protokoll som beskrivs i detta arbete sträcker sig längre än det fall som illustreras. I takt med att tillgången till 2PP-utskriftstekniken blir allt mer utbredd kommer den initiala investeringen som krävs för dess implementering att minska samtidigt som dess utbud av potentiella tillämpningar kommer att utökas.
The authors have nothing to disclose.
M.G. erkänner ekonomiskt stöd från Europeiska unionens ramprogram Horisont 2020 genom Europeiska innovationsrådet (IN-FET-projektet, GA n. 862882, Arbor-IO-projektet, FLAG-ERA och Human Brain Project, ID 650003) och från SISSA (Neuroscience Area). G.N. erkänner ekonomiskt stöd från det italienska ministeriet för universitet och forskning (MUR) genom bidraget Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikområdet). Vi tackar M. Gigante, B. Pastore och M. Grandolfo för deras hjälp med 3D-utskrift, cellodling och live-imaging, samt Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente och H.C. Schultheiss för diskussioner. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-AP5 | Tocris | #0106 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |