3D-udskrivning på mikrometerskala muliggør hurtig prototyping af polymere enheder til neuronale cellekulturer. Som et bevis på princippet blev strukturelle forbindelser mellem neuroner begrænset ved at skabe barrierer og kanaler, der påvirker neuritudvækst, mens de funktionelle konsekvenser af sådan manipulation blev observeret ved ekstracellulær elektrofysiologi.
Neuronale kulturer har været en reference eksperimentel model i flere årtier. Imidlertid mangler 3D-cellearrangement, rumlige begrænsninger på neuritudvækst og realistisk synaptisk forbindelse. Sidstnævnte begrænser studiet af struktur og funktion i forbindelse med opdeling og mindsker betydningen af kulturer i neurovidenskab. Tilnærmelse ex vivo det strukturerede anatomiske arrangement af synaptisk forbindelse er ikke trivielt, på trods af at det er nøglen til fremkomsten af rytmer, synaptisk plasticitet og i sidste ende hjernens patofysiologi. Her anvendes to-fotonpolymerisation (2PP) som en 3D-printteknik, der muliggør hurtig fremstilling af polymere cellekulturindretninger ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) i mikrometerskala. Sammenlignet med konventionelle replika støbning teknikker baseret på mikrofotolitografi, 2PP mikro-skala udskrivning muliggør hurtig og overkommelig turnaround af prototyper. Denne protokol illustrerer design og fremstilling af PDMS-baserede mikrofluidiske enheder med det formål at dyrke modulære neuronale netværk. Som et bevis på princippet præsenteres en to-kammer enhed for fysisk at begrænse tilslutningen. Specifikt foretrækkes en asymmetrisk aksonal udvækst under ex vivo-udvikling og tillades at blive rettet fra det ene kammer til det andet. For at undersøge de funktionelle konsekvenser af ensrettede synaptiske interaktioner vælges kommercielle mikroelektrodearrayer til at overvåge den bioelektriske aktivitet af sammenkoblede neuronale moduler. Her illustreres metoder til 1) at fremstille forme med mikrometerpræcision og 2) udføre in vitro multisite ekstracellulære optagelser i rottekortikale neuronale kulturer. Ved at reducere omkostningerne og den fremtidige udbredte tilgængelighed af 2PP 3D-print vil denne metode blive mere og mere relevant på tværs af forskningslaboratorier verden over. Især inden for neuroteknologi og neurale dataoptagelse med høj kapacitet vil letheden og hurtigheden af prototypeforenklede in vitro-modeller forbedre eksperimentel kontrol og teoretisk forståelse af in vivo store neurale systemer.
Undersøgelse af neuronal aktivitet i opførende organismer giver flere udfordringer. For eksempel er fysisk adgang til hjernevævet begrænset af behovet for at bevare dets integritet, så hjernens overfladiske regioner lettere overvejes. Isolering af specifikke mål i det intakte væv er ofte en skræmmende opgave og undertiden umulig. Selvom dissocierede homogene neuronale kulturer giver nem adgang til de molekylære, biokemiske og biofysiske egenskaber af individuelle (sub) cellulære komponenter i et neuralt kredsløb, går en realistisk forbindelse og anatomisk organisering af den intakte hjerne tabt. Disse grundlæggende begrænsninger inspirerede forskningsindsatsen for at opnå en mellemvej, hvor in vivo-kompleksitet undgås, mens strukturen kan konstrueres in vitro, hvilket er efter behov 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Især modulære neuronale kulturer har været genstand for omfattende forskning i de sidste årtier med det formål at tackle centrale spørgsmål om hjernefysiologi som beskrevet nedenfor.
Organisation: In vivo undersøgelser viser, at hjernen er struktureret anatomisk i lag med præcise celletyper og arrays af fremskrivninger. Funktionelle assays afslørede organiseringen af neuronale netværk i nodesamlinger og moduler med præcise forbindelsesskemaer10,11. Konnektivitetens og mikrokredsløbsmotivernes rolle kan imidlertid ikke undersøges tilstrækkeligt in vivo på grund af det store antal synapser, der er involveret, samt de sammenvævede virkninger af udvikling og aktivitetsafhængig plasticitet.
Signaloverførsel: I in vivo eller tilfældige in vitro-kulturer er det udfordrende at vurdere signaloverførsel. Undersøgelse af aksonal ledning og handlingspotentiale langs dens længde kræver styring af neuritudvækst ved overfladefunktionalisering eller kemisk mønster, hvilket giver et højt signal-støj-forhold i ekstracellulære aflæsninger af elektrisk aktivitet12.
Translationel relevans: Dekryptering af den eksklusive rolle af præ- versus postsynaptiske elementer på tværs af patologiske tilstande kræver at have adgang til disse elementer individuelt. Modulære kulturer med begrænset konnektivitet, der effektivt adskiller de præ- og postsynaptiske elementer, er uundværlige værktøjer til dette formål13.
Der findes flere metoder til at opnå en form for struktur i neuronal kultur. De kan bredt kategoriseres som kemisk og fysisk overflademanipulation9. De tidligere metoder 14,15 er afhængige af neuronale cellers tilbøjelighed til at binde sig til visse (bio) kemiske forbindelser. Dette kræver deponering af klæbemiddel eller attraktive molekyler på en overflade med mikroskalapræcision og efter et detaljeret mønster. Mens dette tillader en delvis dækning af overfladen af cellerne, efter det ønskede mønster, er kemiske metoder i sagens natur begrænsede og har en relativt lav succesrate i neurit vækstvejledning 16. Fuld kontrol over axonretningsvirkning kræver etablering af en rumlig gradient af ad hoc-kemikalier for at forme aksonal vejledning17. Sidstnævnte metoder involverer fysisk overflademanipulation og bruges mere almindeligt til at strukturere neuronale netværk in vitro. Neuronale celler er fysisk begrænset på ønskede steder af geometriske indeslutninger, såsom mikroskopiske kamre, vægge, kanaler osv., Formning af en biokompatibel polymer såsom polydimethylsiloxan (PDMS) 3,5,6,7,18,19,20 hærdet og størknet til en mikrofluidisk enhed. De facto-metoden til PDMS-mikrofluidisk fabrikation er blød fotolitografi21, hvor en todimensionel maske er mønstret i mikroskala og anvendes til selektivt at ætse et siliciumbaseret materiale ved UV-eksponering. I en nøddeskal overtrækkes en UV-hærdelig harpiks (dvs. fotoresist) på en siliciumskive gennem spin-belægning og når en bestemt højde bestemt af dens viskositet og spindehastighed. Derefter placeres den mønstrede maske over fotoresisten og udsættes for UV-lys. Gennemsigtige områder inden for masken, svarende til områder af interesse, vil lade UV-lys inducere lokaliseret tværbinding af fotoresistmolekylerne. Områderne med ueksponeret fotoresist vaskes væk ved hjælp af et opløsningsmiddel, hvilket resulterer i dannelsen af en masterform. Dette bruges gentagne gange til at bage en elastomer efter eget valg (dvs. PDMS), som derefter graveres med de ønskede geometrier i så mange replikaer som ønsket. En sådan fremstillingsmetode er den mest almindelige metode til fremstilling af mikrofluidiske anordninger22. Måske er de største begrænsninger ved blød fotolitografi forudsætningen for bemærkelsesværdige kapitalinvesteringer og biologiske laboratoriers manglende kendskab til de krævede teknikker og ekspertise. Forberedelsen af masken og trinene i blød fotolitografi, der kræves for at designe komplekse geometrier med flere højder, er ikke-trivielle23 og kræver ofte outsourcing. Selv om der er foreslået alternative lavbudgetmetoder, opfylder de ikke altid de høje præcisionskrav til biologisk prototypefremstilling24.
Her præsenteres en alternativ fremstillingsmetode, der er afhængig af to-fotonpolymerisation (2PP) og additiv fremstilling. Det er ligetil og kræver ikke i sig selv avanceret mikrofabrikation og mikrofotolitografiekspertise. Forskningsfeltet 2PP mikrofremstilling opstod i slutningen af 90’erne25, og siden da har det været vidne til eksponentiel vækst26. Mere om de grundlæggende principper for denne teknik kan findes andetsteds26. Kort sagt, ved at fokusere excitationslysimpulsen i tredimensionelt rum, udnytter 2PP den ikke-lineære afhængighed af multifotonabsorption af intensitet. Dette giver mulighed for begrænset absorption, hvilket sikrer præcis og selektiv excitation inden for meget lokaliserede regioner. I det væsentlige udsættes en negativtonefotoresist, et materiale med nedsat opløselighed ved lyseksponering, for en fokuseret stråle af femtosekundlaserimpulser ved en lav arbejdscyklus27. Dette giver mulighed for impulser med høje intensiteter ved lave gennemsnitlige kræfter, hvilket muliggør polymerisering uden at skade materialet. Interaktionen mellem fotoinducerede radikalmonomerer giver anledning til radikale oligomerer, der initierer polymerisation, der strækker sig gennem fotoresisten op til et særskilt volumen, dvs. voxel, hvis størrelse afhænger af intensiteten og varigheden af laserpulserne28.
I dette arbejde præsenteres to komponenter: A) design og hurtig fremstilling af en 3D-trykt form, der kan genbruges mange gange til fremstilling af engangspolymere neuronale cellekulturanordninger (figur 1), og B) deres mekaniske kobling på overfladen af plane neuronale cellekultursubstrater eller endda af substratintegrerede mikroelektrodearrayer, der er i stand til multisite-optagelser af bioelektriske signaler.
Computer Assisted Design af en 3D mekanisk model er meget kort beskrevet her og ledsaget af trinene, der fører til en 3D-printet form og fremstilling af PDMS-enheder er også detaljeret.
En række computerstøttede designsoftwareapplikationer kan bruges til at generere den startende 3D-objektmodel og producere en STL-fil til styring af 2PP-udskrivningsprocessen. Inden for materialefortegnelsen er de første og de sidste applikationer, der er angivet, gratis eller forsynet med en gratis licens. Konstruktion af en 3D-model kræver altid, at der oprettes en 2D-skitse, som derefter ekstruderes i efterfølgende modelleringstrin. For at demonstrere dette koncept fremhæves en generisk 3D CAD-softwaredesignproces i protokolafsnittet, hvilket fører til en struktur lavet af overlappende terninger. For mere omfattende information er en række online tutorials og gratis træningsressourcer tilgængelige, som angivet i materialetabellen.
Den resulterende STL-fil oversættes derefter til en række kommandoer, der skal udføres af 3D-printeren (dvs. udskæringsprocedure). For den specifikke 2PP 3D-printer i brug, softwaren DeScribe bruges til at importere STL-filen og konvertere den til proprietært General Writing Language (GWL) format. Succesen med 2PP-udskrivningsprocessen afhænger af forskellige parametre, især laserkraft og dens scanningshastighed, syning og ruge-udskæringsafstande. Valget af disse parametre sammen med valget af objektiv og fotoresist afhænger af designets mindste funktioner såvel som den tilsigtede anvendelse. Således bliver parameteroptimering afgørende for at opfylde kravene i forskellige designscenarier og brugssager. Til dette arbejde er den anbefalede opskrift IP-S 25x ITO Shell (3D MF) blevet betragtet som en konfiguration for udskrivningsparametrene. I sidste ende udskrives en mekanisk stabil printet del med den nødvendige opløsning, samtidig med at dens 3D-printtid minimeres.
Formdesignet og den relaterede STL-fil, der demonstreres i dette arbejde, består af en firkantet ramme til at adskille rummet i en cellekultur i to rum: et ydre område (dvs. omtalt som kilde efterfølgende) og et indre område (dvs. omtalt som mål efterfølgende). Disse to rum er forbundet gennem sæt mikrokanaler, der hver især er kendetegnet ved skarpe vinkelgrænser, designet til specifikt at hindre væksten af neuritter fra målet til kilden, men ikke omvendt, og som sådan fremme en retningsbestemt synaptisk forbindelse mellem neuroner, der vokser på de to områder.
Tidligere undersøgelser anvendte forskellige geometrier af mikrokanaler for at fremme retningsbestemt vækst af neuritter. Eksempler omfatter trekantede former18, kanalpiggestrukturer19 og tilspidsede kanaler20. Her anvendes et design med skarpe vinkelbarrierer på tværs af mikrokanalens grænser, der også er kendetegnet ved asymmetriske indgange. Disse mikrokanaler tjener til at etablere kontinuitet mellem et lukket indre, målrummet, og det ydre område, kilderummet. Tragtformen på den indledende del af mikrokanalerne, fra kildesiden, er designet til at fremme dannelsen af aksonale bundter og deres vækst langs den korteste, dvs. lige linje, sti, der forbinder kilden med målet. Det trekantede rum, der realiseres ved at vende mod skarpe vinkler, har større volumen på målsiden for at sigte mod effektivt at forsinke neuritternes stifinding, samtidig med at man favoriserer hurtig optagelse af bundter, der stammer fra kilden og besættelse af det tilgængelige rum. Valget af 540 μm for mikrokanalernes længde filtrerer effektivt den generelt kortere dendritiske udvækst39. Derudover forhindrer deres 5 μm højde cellesomata i at trænge gennem mikrokanalerne. Samlet set viste denne konfiguration sig at fremme ensrettet forbindelse mellem de ydre, kilde og indre målmoduler, og den præsenteres her som et principbevis blandt de mange alternative valg.
Mens PDMS-enhederne, fremstillet af 2PP-formen, kan fastgøres til overfladen af almindelige cellekultursubstrater, såsom glasdæksler eller petriskåle, blev der i dette arbejde anvendt kommercielt tilgængelige substratintegrerede mikroelektrodearrayer. Der er ikke gjort noget for at optimere 3D-designet til mikroelektrodearray-layoutet, og den mekaniske kobling blev udført under stereomikroskopivejledning, der kun sigter mod at placere enheden på tværs af arrayet, hvilket efterlader noget mikroelektrode afdækket i begge sider, kilden og målet. Dette muliggør en foreløbig vurdering af de funktionelle konsekvenser af den begrænsede forbindelse i neuronale cellekulturer.
På trods af at den er årtier gammel, er anvendelsen af 2PP-teknologi i mikrometerskala PDMS-baseret replikastøbning en nylig udvikling43,44. I denne sammenhæng diskuteres en række punkter nedenfor for at hjælpe brugerne med effektivt at gengive dette værk.
Ved 3D-modeldesign skal du sikre dig, at modellen ikke har huller eller selvskæringer. Privilegium det binære filformat, når du gemmer som STL, for dets mindre filstørrelse fodaftryk end ASCII-kodet. Dette er især gavnligt for design med indviklede geometrier og for milliliter brede genstande. Brug af binære STL-filer indebærer også lav CPU-belastning, senere i processen forbereder den mekaniske del, der skal 3d-printes. Funktionernes fysiske dimensioner i STL-filen er repræsenteret i dimensionsløse enheder. Under efterbehandling af STL-filen fortolkes enheder som mikrometer. Derfor anbefales det at vedtage på forhånd interesseenheden, dvs. mikrometer, når filen udarbejdes. Nøjagtigheden af den trykte model bestemmes af antallet af overflader, der tilnærmer tessellerede trekanter. For et utilstrækkeligt antal overflader vil uønsket overfladeruhed opstå. Ikke desto mindre kommer målet om overdreven høj nøjagtighed af et meget stort antal overflader til prisen for en høj beregningsbelastning, hvilket får filbehandlingen til at være langsom.
Til 3D-udskrivning dannes det fysiske 3D-objekt under udskrivning ved hjælp af hurtig galvo-scanning i x-y-planet og piezobevægelse i z-retningen. Dette fokuserer femtosekundlaserstrålen inden for en given 3D-voxel. Men når udskrivningsstrukturer er større end galvoens og piezoens rumlige dækningsområder, skal objektet programmatisk opdeles i blokke. Selvom dette er et krav til trykte dele i millimeterstørrelse, er kryds mellem blokke forbundet med (ufuldkomne) sylinjer. Omhyggelig optimering af antallet af blokke og placering af sylinjer i x-, y- og z-retninger er afgørende for at undgå at forstyrre kritiske geometriske træk ved det endelige objekt med syningslinjer. Der kan dannes bobler ved udskrivningsgrænsefladen af forskellige årsager (f.eks. substrater fotoresists urenheder og inhomogeniteter) og påvirke kvaliteten og integriteten af den trykte struktur negativt. Desuden kan højere lasereffekt føre til en stigning i deres forekomst. Reduktion af lasereffekten ved det laveste lag af den trykte del minimerer chancerne for bobledannelse. Som et alternativ til at udskrive hele delen som en solid struktur kan skal- og stilladsmetoden overvejes. Det indebærer kun udskrivning af den ydre overflade af delen (skallen) samt trekantede prismeelementer i den. Disse elementer adskilles af vandrette lag (stillads), der holder den upolymeriserede harpiks i små lommer. Denne metode forkorter udskrivningstiden betydeligt, især relevant for strukturer i millimeterstørrelse. Da der imidlertid forbliver ikke-polymeriseret harpiks, er UV-eksponering efter udskrivning bydende nødvendig for at sikre fuld mekanisk stabilitet, selvom dette trin skal udføres forsigtigt for at undgå deformation af den trykte del. Efterhærdningstiden afhænger af den valgte harpiks, delens tykkelse og UV-effekt40. For optimale resultater anbefales det at gennemføre et indledende forsøg for at estimere den tid, der er nødvendig for hærdning i fuld dybde, ved hjælp af en dråbe fotoresist og evaluere dens sektionssnit efter UV-eksponering. Den sædvanlige hærdningsperiode varierer mellem 5 og 20 min.
For PDMS-replikastøbning kan ren fremstilling af en PDMS-enhed med mikrometerskalafunktioner uden renrumsfaciliteter være udfordrende: luftbårne mikropartikler kan opholde sig på PDMS’ens stærkt klæbende overflade og hindre tætningen mellem enheden og substratet eller blokere sektionen af individuelle mikrokanaler. Udførelse af protokoltrinnene under en laminær strømningshætte og konsekvent afskærmning af PDMS-overfladen med isopropanol minimerer kontamineringsrisikoen betydeligt. Hærdningstemperaturen og dens varighed påvirker direkte PDMS-tværbinding og de resulterende fysiske egenskaber. Især klæbeevnen af hærdet PDMS er en kritisk faktor. På den ene side kræves en tæt forsegling mellem PDMS-enheden og overfladen, der anvendes til neuronal celledyrkning (f.eks. Et glasdæksel eller et MEA) for effektivt at begrænse neuritternes passage. På den anden side skal PDMS-enheden fastgøres til overfladen reversibelt, så det sarte isolerende lag MEA’er ikke beskadiges efter fjernelse af enheden. Mens PDMS-krympning under hærdning forekommer og kan korrigeres ved forudgående reskalering af formen, vil krympning for temperaturer og hærdningsintervaller, der er angivet her, være mindre end 2%42 og vil ikke påvirke signifikant, enkeltlags PDMS-enheder. Samlet set skal du nøjagtigt følge de anbefalede hærdningstemperatur- og varighedsværdier for de bedste resultater.
Oversigt over fordele og begrænsninger ved metoden
En teknik baseret på 2-foton direkte laserskrivning foreslås til hurtig fremstilling af mikroskala polymere enheder til eksperimentel undersøgelse af modulære neurale netværk. I modsætning til blød fotolitografi kræver den foreslåede tilgang ikke et højt niveau af teknisk ekspertise, forudsat at en funktionel 2PP 3D-printopsætning er tilgængelig og operationel. Bemærkelsesværdigt gør metoden det muligt at gå fra en CAD-designet 3D-model til en funktionel PDMS-enhed inden for en enkelt dag, hvilket giver en direkte og effektiv vej fra koncept til håndgribelig realisering. Specifikt reducerer valg af skal-og-stilladsudskrivningstilstand betydeligt den tid, der er nødvendig for at skabe formen, da kun en brøkdel af dens volumen udskrives. Efterfølgende UV-hærdning af den printede komponent garanterer dens mekaniske stabilitet og robusthed, som verificeret her over 50 støbecyklusser med PDMS.
Sammenlignet med traditionelle metoder har 2PP 3D-print en klar fordel, som er mest udtalt, når det kommer til fremstilling af forme med et betydeligt billedformat, krævende opløsningskrav og komplekse tredimensionelle geometrier. Produktionen af masterforme ved hjælp af standard UV-litografi er begrænset af en modstandstykkelse på ca. 200 μm. Indviklede sekvenser af spin-belægning og eksponeringscyklusser35, dyre LIGA (litografi, galvanisering og støbning) eller dyb reaktiv ionætsning (DRIE) processer36 er nødvendige for at opnå større højde- og billedformater. I skarp kontrast, som demonstreret i Kumi et al.’s banebrydende arbejde i 201037, tilbyder 2PP-teknikken et i det væsentlige ubegrænset omfang for billedformatet for de trykte dele, der spænder fra submikrometer til millimeter. Her er mikrofremstillingsprocessen for en form med betydelig forskel i højden af dens portioner blevet eksemplificeret med over en 100 gange skelnen mellem mikrokanalernes højde (5 μm og den maksimale formens højde (545 μm; se figur 2).
Submikrometeropløsning kan også let opnås ved at følge de skitserede protokolspecifikationer. Til sammenligning kræver det kapitalinvesteringer at opnå forbedrede formopløsninger gennem UV-fotolitografi. Maskerne med den fineste opløsning, der udnytter kromaflejring på kvarts med en nominel opløsning på 600 nm, er prissat flere størrelsesordener højere end de lasertrykte overliggende gennemsigtighedsmasker, som har en opløsning på 250 μm35, se dog arbejdet med Pirlo et al.41. For at være levedygtig til intern brug skal en valgt metode være omkostningseffektiv. For mange biologiske laboratorier udgør den samlede udgift forbundet med konventionel blød fotolitografi eller direkte laserskrivning en barriere. Selv om det er muligt at gøre begge teknologier mere tilgængelige ved at købe og samle de væsentlige komponenter, kræver denne tilgang yderligere ekspertise og kræver stadig en betydelig investering. I denne sammenhæng er et vigtigt punkt at overveje det bredere spektrum af applikationer, der kan opnås gennem direkte laserskrivning. I modsætning til konventionel blød fotolitografi, primært begrænset til formmikroproduktion, udviser 2PP 3D-udskrivning bemærkelsesværdig alsidighed. Dens potentielle anvendelser spænder fra mikrofluidik og mikrooptik til integreret fotonik og mikromekanik. Dette gør investering i denne teknologi tiltalende som en fælles facilitet for flere og forskellige videnskabelige områder. For eksempel er den 2PP-baserede metode, der er udviklet i denne protokol, resultatet af et tværfagligt samarbejde mellem neurovidenskabs- og matematikafdelinger inden for vores institution. Derudover er fotoresistudviklingen et aktivt forskningsfelt og kan potentielt udvide anvendelsesområdet for 2PP 3D-udskrivning. Et eksempel herpå er den nylige introduktion af IP-PDMS-harpiks. Ved at polymerisere til strukturer med egenskaber som PDMS38 frigør denne harpiks potentialet for direkte mikrofabrikation af biokompatible komponenter, der har indviklet overflade eller indeholder hule rum. Disse forviklinger står som barrierer for at opnå lignende resultater gennem konventionelle replikastøbningsprocedurer.
Som en demonstration af denne metode blev der fremlagt beviser, der tyder på udviklingen af ensrettet forbindelse mellem to moduler i et modulært neuronalt netværk. Mikroskalaformen, fremstillet ved 2PP-teknik, havde tilstrækkelig udholdenhed til at gennemgå flere PDMS-støbning og har den krævede præcision i mikroskala. Afslutningsvis strækker anvendelsesområdet for den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, sig ud over det illustrerede tilfælde. Efterhånden som adgangen til 2PP-printteknologien bliver mere og mere udbredt, vil den indledende investering, der kræves til dens implementering, falde, mens dens vifte af potentielle applikationer vil blive udvidet.
The authors have nothing to disclose.
M.G. anerkender økonomisk støtte fra EU’s H2020-rammeprogram gennem Det Europæiske Innovationsråd (IN-FET-projekt, GA n. 862882, Arbor-IO-projektet, FLAG-ERA og Human Brain Project, ID 650003) og fra SISSA (Neuroscience Area). G.N. anerkender økonomisk støtte fra det italienske ministerium for universitet og forskning (MUR) gennem bevillingen Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikområdet). Vi takker M. Gigante, B. Pastore og M. Grandolfo for deres hjælp med 3D-print, celledyrkning og live-billeddannelse samt Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente og H.C. Schultheiss for diskussioner. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet.
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-AP5 | Tocris | #0106 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |