Vi beskriver et screeningsystems arbeidsflyt og dataanalyse for evaluering av kjemisk forbindelsestoksisitet basert på sebrafiskembryoens vibrasjonsrespons. Systemet registrerer bevegelsene til sebrafiskembryoer ved eksponering for vibrasjonsstimulus og muliggjør en integrert evaluering av generell toksisitet/dødelighet og nevromuskulær toksisitet.
Vi utviklet et enkelt screeningsystem for evaluering av nevromuskulær og generell toksisitet i sebrafiskembryoer. Det modulære systemet består av elektrodynamiske transdusere, over hvilke vevskulturretter med embryoer kan plasseres. Flere slike høyhøyttaler-vevskulturparabolpar kan kombineres. Vibrasjonsstimuli generert av de elektrodynamiske transduserne induserer en karakteristisk skremme- og rømningsrespons i embryoene. En beltedrevet lineær stasjon plasserer sekvensielt et kamera over hver høyttaler for å registrere bevegelsen til embryoene. På denne måten kan endringer i skremmeresponsen på grunn av dødelighet eller nevromuskulær toksisitet av kjemiske forbindelser visualiseres og kvantifiseres. Vi presenterer et eksempel på arbeidsflyten for kjemisk sammensatt screening ved hjelp av dette systemet, inkludert fremstilling av embryoer og behandlingsløsninger, drift av registreringssystemet og dataanalyse for å beregne referansekonsentrasjonsverdier for forbindelser som er aktive i analysen. Den modulære monteringen basert på kommersielt tilgjengelige enkle komponenter gjør dette systemet både økonomisk og fleksibelt tilpasningsdyktig til behovene til bestemte laboratorieoppsett og screeningformål.
I de senere år har sebrafisk blitt svært populære modellorganismer for evaluering av kjemiske sammensatte effekter, som omfatter forskningsområder fra legemiddelutvikling til miljøtoksikologi1. Som virveldyr deler sebrafisk mange aspekter av deres genetiske sminke og generelle fysiologi med mennesker 2,3. Derfor er resultater oppnådd i denne modellen ofte direkte relevante for menneskers helse. Flere legemiddelkandidater som for tiden er i kliniske studier har blitt identifisert i sammensatte skjermer ved bruk av sebrafisk4.
Toksisitetsvurdering er en stor applikasjon der tester med sebrafiskembryonale stadier er av interesse. Det finnes ulike testretningslinjer fra Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) for bruk av sebrafisk i testing av miljøgifter 5,6. Den lille størrelsen og raske utviklingen av sebrafiskembryoer gjør dem svært egnet for screeningtilnærminger på en middels til høy gjennomstrømningsskala 1,3,4. Toksikologiske endepunkter rettet mot slike skjermer inkluderer embryonale misdannelser og dødelighet7, hormonforstyrrelser8, organtoksisitet9 og atferdsvurderinger som indikerer nevral toksisitet10,11. Atferdsanalysene er mulige fordi sebrafiskembryoer viser ulike typer lokomotoriske responser på forskjellige stimuli avhengig av utviklingsstadiet. For eksempel viser 1 dag etter befruktning (dpf) embryoer spontan hale coiling12 og reagerer på en sekvens av lyspulser med en typisk sekvens av bevegelser, den såkalte fotomotoriske responsen (PMR) 10. Etter klekking, som vanligvis forekommer rundt 48-72 timer etter befruktning (hpf), utvikler de fritt svømmende eleutheroembryoene13 gradvis skremsel og unnslipper responser på vibrasjonsstimuli som starter rundt 4 dpf14. Disse responsene er preget av en særegen bøyning til retningen motsatt retning av stimulansen (den såkalte C-bend eller C-start), som etterfølges av en mindre motbøyning og svømmeoppførsel 14,15,16,17. Spesielt styres embryonal atferd av nevrale kretser ved hjelp av forskjellige nevrotransmittersystemer, noe som gjør det mulig å undersøke kjemiske sammensatte effekter rettet mot disse systemene. For eksempel avslørte PMR-analysen effekten av forbindelser som forstyrrer kolinerg, adrenerg og dopaminerg signalering10, mens skremmeresponsen involverer kolinerge, glutamaterge og glycinerge nevroner 16,18. Videre vil forbindelser som skader musklene eller det nevromuskulære grensesnittet også påvirke disse atferdene, og det samme vil forbindelser som er giftige for hårcellene i det indre øret / sidelinjen19,20. Observasjon av sebrafiskens lokomotoriske atferd som respons på en stimulus er derfor et egnet middel for å vurdere ikke bare nevrotoksisitet, men like ototoksisitet og myotoksisitet. Scoring lokomotorisk oppførsel fungerer også som en proxy for generell toksisitet / dødelighetsvurdering siden døde embryoer ikke beveger seg. Dermed representerer embryonal bevegelsesadferd en integrert avlesning for en første-tier toksisitetsscreening-tilnærming, som indikerer dødelige og nevromuskulære sammensatte effekter i ett oppsett. Gitt at eleutheroembryoene allerede er i stand til å metabolisere forbindelser, kan tilnærmingen også oppdage effekten av metabolske transformasjonsprodukter 7,21,22. Det er viktig at sebrafiskembryoer ikke anses som beskyttet livsstadium i henhold til noen dyrevernlovgivninger før stadiet med fri fôring etter 120 hpf13. Derfor betraktes de som et alternativ til testing av toksisitet hos dyr.
Figur 1: Oppsett av vibrasjonsskremmende responssystem. (A) Oversikt over systemet. Plater med embryoer utsatt for testforbindelsene plasseres på den elektrodynamiske transdusergruppen (“høyttalere”). Kameraet beveges sekvensielt av den beltedrevne lineære stasjonen til opptaksposisjonen over måltransduseren. (B) Detaljert visning av svingeren/høyttaleren med tallerkenen vevskultur satt inn på toppen. Platene belyses nedenfra av et LED-lysark på 4000-5000 lux. Et LED-lys ved siden av høyttaleren lyser mens stimulansen gis. (C) Stillbilde av video tatt opp av kameraet ved stimulering av embryoene. (D) Skjermbilde av konfigurasjonsfilen. (E) Skjermbilde av grensesnittet for innspillingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Her beskriver vi en testprotokoll for evaluering av sammensatte effekter på vibrasjonsskremmeresponsen ved hjelp av en intern konstruksjonsenkel testenhet basert på vibrasjonsstimuli generert av elektrodynamiske transdusere kombinert med et automatisert videoopptak av flere fritt bevegelige embryoer i en vevskulturskål23. Systemet er modulært og muliggjør sekvensiell registrering fra flere vevskulturskåler parallelt. I oppsettet som brukes i dag, gir fem elektrodynamiske transdusere en vibrasjonsstimulus (500 Hz, varighet 1 ms) til vevskulturskåler som inneholder 20 embryoer plassert på toppen av dem (figur 1). Platene er opplyst nedenfra ved 4000-5000 lux med LED-lysplater. Et LED-lys ved siden av hver svinger indikerer perioder med stimuluspåføring, og et oscilloskop indikerer bølgeformer og frekvens av den påførte stimulansen (for detaljer, se Ref. 23). Oppførselen til embryoene registreres av et høyhastighetskamera (materialfortegnelse) med 1000 bilder per sekund (fps), som beveges over målhøyttaleren av en beltedrevet lineær stasjon. Denne opptakshastigheten er nødvendig for å løse skremmeresponsen på en pålitelig måte. Systemet gir et rimelig, individuelt tilpasningsdyktig alternativ til dagens kommersielle systemer. Den nøyaktige arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor, utføres for tiden innenfor rammen av Precision Toxicology initiative24 for å bestemme passende eksponeringsforhold for OMICS-datainnsamling fra sebrafiskembryoer behandlet med et utvalgt sett med toksiske stoffer.
Vi presenterer arbeidsflyten og dataanalysen for kjemisk sammensetningsevaluering ved hjelp av et spesialbygd oppsett for sebrafiskembryovibrasjonsskremmelse. Arbeidsflyten genererer robuste data som gjør det mulig å beregne typiske parametere som spesifiserer forbindelsestoksisitet, for eksempel referansekonsentrasjon/dose (BMC/BMD). Modulariteten i oppsettet tillater tilpasning til ulike behov for gjennomstrømning og plassbehov. Siden systemet er laget av rimelige basale komponenter, etter et relativt enkelt oppsett, gir det et billig alternativ til eksisterende kommersielle systemer, som vanligvis er designet for flere analysetyper samtidig, stole på proprietær programvare og forbli relativt kostbare.
Både disse kommersielle systemene og andre skreddersydde systemer tillater vurdering av enkeltembryoer eller larver i flerbrønnsplater (f.eks. 12-brønn34, 16-brønn32,35, 24-brønn 20,33,36, 48-brønn 37, 96-brønn 38,39,40,41,42 og til og med 384-brønn [som 4×96-brønn]43), men den romlige begrensningen i brønnene gjør analysen av noen dataparametere for rømningsresponsen (f.eks. tilbakelagt distanse) mer utfordrende. Videre, i noen av disse oppsettene, er avbildning begrenset til en delmengde av brønnene på platen, noe som reduserer gjennomstrømningen36,39. Avbildning av embryoer i skåler muliggjør bedre vurdering av rømningsresponsparametere og gjør det mulig å registrere oppførselen til flere embryoer samtidig (opptil 30 i en 6 cm tallerken, for eksempel). Vanligvis er parabolbasert avbildning begrenset til en tallerken per løp 44,45,46,47,48 (unntak utfører avbildning parallelt på 6 retter med en larve hver49 eller på 4 larver i 2 splittretter50), en ulempe som kan løses ved parallelle design som i vårt tilfelle. Vi har oppsummert noen kjennetegn ved systemet som er brukt i denne studien og andre kommersielle og skreddersydde løsninger i tabell 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.
En fordel med metoden er en avlesning som fanger opp både dødelighet og atferdsendringer, noe som kan øke ytelsen til toksisitetsvurderinger. For eksempel, mens sebrafiskfiskembryoens akutte toksisitetstest (FET)5 har vist seg å forutsi toksisitet i voksenfiskens akutte toksisitetstest53 ganske bra, ble prediksjonsnøyaktigheten forbedret ved å inkludere atferdsavlesninger54. Årsaken til dette er den svake dødeligheten forårsaket av nevroaktive forbindelser sett i fiskeembryoer, sannsynligvis på grunn av mangel på respirasjonssviktsyndrom som forårsaker økt toksisitet hos ungfisk eller voksen fisk. Nevroaktivitet kan imidlertid identifiseres ved vurdering av atferd. Videre kan atferdsavlesninger også fange myotoksiske og ototoksiske effekter, samt andre, mer subtile toksiske effekter på fysiologi, som er subletale, men påvirker organismens atferdsytelse.
Når analysen utføres, er det avgjørende å sikre riktig håndtering av forbindelser, samt å bruke et homogent utviklende parti sebrafiskembryoer. Bruk av glassflasker til oppbevaring av forbindelser bør derfor minimere nedgangen i konsentrasjoner av kjemikalier, spesielt hydrofobe forbindelser, på grunn av absorbans til plastmateriale. Ved forbindelser med høyt absorberende potensial til “plast” polystyren, kan glassplater også brukes til inkubasjonen. Rengjøring av eggene i vevskulturskålene som brukes til innsamling og fjerning av døde embryoer er et kritisk skritt for å sikre standardutvikling. Normal utviklingshastighet er viktig, da utviklingsforsinkelser kan påvirke modenheten til nevrale nettverk som ligger til grunn for den vurderte oppførselen14,33. For å muliggjøre sammenligning av sammensatte effekter, bør egg avledes fra samme stamme siden forskjellige stammer har blitt rapportert å presentere forskjellige atferdsprofiler 38,55,56,57. Under eksponering er det viktig å inkubere embryoene i et fuktet kammer for å unngå overdreven fordampning av E3-mediet, noe som vil endre konsentrasjonene som er testet.
E3-kontroller bør innlemmes i hver kjøring for å bestemme baselineresponsnivået for den bestemte gruppen embryoer som brukes i testserien. Vanligvis kjører vi en plate med kontroller langs hvert sett med 5 målinger. Som illustrert i figur 2D, tillater denne tilnærmingen også deteksjon av partier med suboptimale responser på grunn av forsinket utvikling eller av andre grunner, for eksempel genetiske bakgrunnseffekter. I tilfelle en uventet mangel på respons på stimulansen, må du også se opp for potensiell transduserfeil. Vanligvis viser skremmeresponsene en sigmoidal konsentrasjon-respons-oppførsel som muliggjør kurvetilpasning ved hjelp av en log-logistisk modell. I sjeldne tilfeller med bifasiske responser kan det imidlertid hende at andre modeller må brukes, for eksempel Gauss- eller Cedergreen-modeller. De er tilgjengelige i R-pakkene drc og bdm27,28.
Mangelen på respons på vibrasjonsstimulansen kan ganske enkelt indikere embryoens død eller alvorlig svekkede livsfunksjoner på grunn av generell cytotoksisitet, men kan også gjenspeile mer spesifikk toksisitet rettet mot nevrale kretser av stimuluspersepsjon, integrasjon og lokomotorisk utgang. Andre mulige sammensatte effekter er interferens med det nevromuskulære grensesnittet eller med muskelstruktur og funksjon. For å skille mellom disse mulighetene, er det nødvendig med ytterligere analyser. For eksempel kan den strukturelle integriteten til musklene vurderes med en birefringency-analyse58,59, og transgene linjer er tilgjengelige for å vurdere forstyrrelse av muskel- og nevralfunksjon60,61. Imidlertid tillater de innspilte videodataene allerede en mer detaljert analyse av morfologien og atferdsresponsen til embryoene som kan gi første tilleggsinformasjon. Er bare C-bøyningen svekket, eller all bevegelighet? Er fortsatt rester av nevromuskulær aktivitet tilstede, som indikert ved svake eller skjelvende halebevegelser? Går slike endrede atferd sammen med endringer i morfologi, som ødem eller økt kroppskrumning? I tillegg kan parametere som latenstid til C-svingen eller tilbakelagt distanse under rømningsresponsen evalueres (se for eksempel Ref. 44).
Screeningprotokollen beskrevet her tillater raske og robuste sammensatte toksisitetsevalueringer, med merverdien av spesifikt å oppdage ikke-dødelige nevrotoksiske, ototoksiske og myotoksiske forbindelser. Den medfølgende analysearbeidsflyten er enkel å implementere og gir en robust avlesning. Modifikasjoner av stimulusprotokollene som brukes i vibrasjonsskremmeanalysen har blitt brukt til å adressere sammensatte effekter på mer komplekse aspekter av skremmeatferd også, for eksempel prepulshemming (PPI) 39,44 og habituering32,33, og kan tilpasses det elektrodynamiske transduserbaserte stimulusoppsettet som ble brukt i denne studien.
En hovedanvendelse av skremmeresponsbaserte screeningsystemer er vurdering av sammensatte effekter i kjemiske skjermer, noe som er relevant både for human toksisitetsevaluering og legemiddelutvikling 1,4,62. Samtidig, ved å teste de tidlige livsstadiene til en vannlevende organisme, har de oppnådde resultatene direkte relevans for økotoksikologisk risikovurdering63,64. I tillegg kan skremmeresponssystemer brukes til atferdsfenotyping i genetiske skjermer 65,66,67,68,69. Vårt lett implementerbare og tilpasningsdyktige system gir et rimelig oppsett til mindre laboratorier som har til hensikt å gjennomføre sine egne spesifikke screeningprosjekter i disse ulike anvendelsesområdene.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker for den utmerkede tekniske assistansen fra støttepersonalet på IBCS-BIP fiskeanlegg og screeningsenter. Dette arbeidet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Grant Agreement No 965406 (PrecisionTox). Dette resultatet gjenspeiler bare forfatternes syn, og EU kan ikke holdes ansvarlig for eventuell bruk av informasjonen som finnes der.
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm | Sigma-Aldrich | Z289744-1EA | Or comparable material |
High-speed camera | XIMEA | MQ013MG-ON USB 3 | |
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap | VWR | 215-3261 | Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 10 µL | SARSTEDT | 70.3010.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 1000 µL | SARSTEDT | 70.3050.100 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 20 µL | SARSTEDT | 70.3020.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 200 µL | SARSTEDT | 70.3030.100 | Or comparable material |
Serological pipette 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | Or comparable material |
Serological pipette 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | Or comparable material |
Serological pipette 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | Or comparable material |
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) | Greiner bio-one | 628102 | Or comparable material |
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) | SARSTEDT | 83.3902.500 | Or comparable material |
Transfer pipette 6 mL | SARSTEDT | 86.1175 | Or comparable material |
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP | SARSTEDT | 62.554.502 | Or comparable material |
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP | SARSTEDT | 62.5472.54 | Or comparable material |