ثلاث استراتيجيات للحث على التهاب القرنية العصبي وتجديد الأعصاب في قرنية الفئران
Summary
هنا ، نقترح ثلاث طرق مختلفة لإتلاف الألياف الحسية التي تعصب القرنية. تسهل هذه الطرق دراسة تجديد المحور العصبي في الفئران. هذه الطرق الثلاث ، القابلة للتكيف مع النماذج الحيوانية الأخرى ، مثالية لدراسة فسيولوجيا تعصيب القرنية وتجديدها.
Abstract
القرنية هي نسيج شفاف يغطي العين وهو ضروري لرؤية واضحة. هذا هو النسيج الأكثر تعصبا في الجسم. يوفر هذا التعصيب الإحساس والوظيفة الغذائية للعين ويساهم في الحفاظ على سلامة القرنية. يسمى الاضطراب المرضي لهذا التعصيب التهاب القرنية العصبي. يمكن أن يحدث هذا بسبب إصابة العين أو الجراحة أو المرض. في هذه الدراسة ، نقترح ثلاثة بروتوكولات مختلفة لإلحاق الضرر بالتعصيب بطرق تلخص الأنواع الثلاثة من الحالات التي تتم مواجهتها بشكل عام في العيادة.
تتمثل الطريقة الأولى في عمل تآكل للظهارة باستخدام لدغ عيني. يتضمن ذلك إزالة الطبقة الظهارية والنهايات العصبية الحرة والضفيرة تحت القاعدية بطريقة مشابهة لجراحة استئصال القرنية الانكسارية الضوئية التي يتم إجراؤها في العيادة. الطريقة الثانية تستهدف فقط التعصيب عن طريق تقسيمه في المحيط بلكمة خزعة ، والحفاظ على سلامة الظهارة. تشبه هذه الطريقة الخطوات الأولى من رأب القرنية الصفائحي وتؤدي إلى تنكس التعصيب يليه إعادة نمو المحاور العصبية في القرنية المركزية. الطريقة الأخيرة تدمر تعصيب نموذج الماوس المعدل وراثيا باستخدام مجهر متعدد الفوتونات ، والذي يحدد على وجه التحديد موقع الكي للألياف العصبية الفلورية. هذه الطريقة تلحق نفس الضرر مثل التهاب القرنية الضوئي ، وهو التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية.
تصف هذه الدراسة خيارات مختلفة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لتعصيب القرنية ، وخاصة تنكس وتجديد المحاور. تعزيز التجديد أمر بالغ الأهمية لتجنب مضاعفات مثل عيوب الظهارة أو حتى ثقب القرنية. يمكن أن تساعد النماذج المقترحة في اختبار جزيئات دوائية جديدة أو علاج جيني يعزز تجديد الأعصاب ويحد من تطور المرض.
Introduction
تتكون القرنية، وهي السطح الشفاف للعين، من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة، والسدى والبطانة. يحتوي هذا العضو على أعلى كثافة للتعصيب في الجسم ويتكون بشكل أساسي من ألياف حسية (النوعان Aδ و C) تنشأ من فرع العيون من العقدة ثلاثية التوائم. تخترق الألياف الحسية محيط القرنية في منتصف السدى على شكل حزم كبيرة تتفرع لتغطية السطح. ثم تتشعب لتخترق غشاء بومان وتشكل الضفيرة تحت القاعدية ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق تكوين دوامة في وسط القرنية. تنتهي هذه الألياف كنهايات عصبية حرة على السطح الخارجي للظهارة. فهي قادرة على تحويل المحفزات الحرارية والميكانيكية والكيميائية وإطلاق العوامل الغذائية الضرورية لتوازن الظهارة 1,2. التهاب القرنية العصبي (NK) هو مرض تنكسي يؤثر على التعصيب الحسي للقرنية. ينبع هذا المرض النادر من انخفاض أو فقدان حساسية القرنية مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الدموع وضعف خصائص الشفاء من القرنية3. يتقدم NK من خلال ثلاث مراحل موصوفة جيدا ، من المرحلة 1 حيث يعاني المرضى من عيوب ظهارية ، إلى المرحلة 3 حيث يحدث ذوبان اللحمة و / أو ثقب القرنية4.
سريريا ، يمكن أن تكون أصول هذا المرض متنوعة. يمكن للمرضى فقدان تعصيب القرنية بعد الإصابة الجسدية للعين أو الجراحة أو من خلال الأمراض المزمنة ، مثل مرض السكري 5,6. حتى الآن ، لا تزال عملية التسبب في NK غير مفهومة بشكل جيد ، والخيارات العلاجية لهذه الحالة التي تهدد البصر محدودة للغاية. لذلك ، هناك حاجة إلى فهم أفضل لخصائص العيوب الظهارية لفهم الآليات الكامنة وراء تجديد تلك الألياف بشكل أفضل وربما تعزيزها. هنا ، نقترح عدة نماذج لإصابة القرنية التي تحفز NK في الفئران.
النموذج الأول هو تآكل الطبقة الظهارية للقرنية مع لدغ العين. تمت دراسة هذا النموذج بشكل أساسي في سياق تجديد الظهارة في المختلفة ، مثل القوارض والأسماك7،8،9 ، واختبار الجزيئات التي تعزز شفاء القرنية10،11. من الناحية الفسيولوجية ، يستغرق الأمر 2-3 أيام حتى تغلق الخلايا الظهارية الجرح. ومع ذلك ، فإن النمط الفسيولوجي للتعصيب يستغرق أكثر من أربعة أسابيع للتعافي من التآكل12,13. أثناء الجراحة ، يزيل نتوء العين الطبقة الظهارية للقرنية التي تحتوي على الضفيرة تحت القاعدية والنهايات العصبية الحرة للألياف. يمكن مقارنة هذا الإجراء سريريا بالمرضى الذين يعانون من استئصال القرنية الانكساري الضوئي (PRK) لتصحيح عيوب انكسار العين. يتكون الإجراء من إزالة ظهارة القرنية ثم إعادة تشكيل السدى باستخدام الليزر14. يمكن للمرضى تجربة العديد من الآثار الجانبية بعد هذه الجراحة ، مثل انخفاض كثافة عصب القرنية لمدة 2 سنوات وانخفاض في الحساسية لمدة 3 أشهر إلى سنة واحدة بعدالجراحة 15. بالنظر إلى أن الجراحة تؤدي إلى هشاشة البيئة المكروية للقرنية ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في التحقيق في هذه الآثار الجانبية وتطوير مناهج علاجية من شأنها تعزيز إعادة التعصيب بشكل أسرع ، وبالتالي تقليل الآثار الجانبية المعنية.
يتكون النموذج الثاني من تقسيم المحاور العصبية في محيط القرنية باستخدام خزعة ، مما يؤدي إلى تنكس والر للتعصيب المركزي 16. سريريا ، يمكن مقارنة هذه الطريقة برأب القرنية الصفائحي الأمامي ، حيث يدرك الجراح عملية نقوش جزئية للقرنية لإزالة جزء من السماكة الأمامية للقرنية واستبدالها بزرع متبرع 17. بعد رأب القرنية الرقائقي ، قد يعاني المرضى من عدد من الأعراض بما في ذلك جفاف العين وفقدان تعصيب القرنية ورفض الكسب غير المشروع18. يمكن أن يوفر نموذج بضع البديهية هذا الذي يتم إجراؤه على أعصاب القرنية نظرة ثاقبة لآليات تنكس الألياف ، والذي يحدث بعد الكسب غير المشروع ، يليه تجديد المحاور.
الطريقة الثالثة تدمر أعصاب القرنية بالليزر. باستخدام مجهر متعدد الفوتونات على قرنية المخدرة ، يحدث تنكس الأعصاب المترجمة في المجال البصري نتيجة لتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي والتجويف الخلوي19. تلخص هذه الطريقة التلف الضوئي للقرنية الناجم عن التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية الطبيعية (حروق الشمس) ، والتي تؤدي أيضا إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي20. يعاني المرضى الذين يعانون من حروق الشمس في القرنية من ألم شديد ، حيث أن تدهور الخلايا الظهارية يحرم أطراف ألياف القرنية من الجميع.
تم تصميم الطرق الثلاث الموضحة هنا لتمكين التحقيق في عملية التسبب في NK وتجديد المحور العصبي. فهي قابلة للتكرار بسهولة ودقيقة. علاوة على ذلك ، فهي تسمح بالشفاء السريع والمراقبة السهلة للحيوانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتبر التهاب القرنية العصبي مرضا نادرا يصيب 5 من كل 10000 فرد. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يعانون من NK بسبب إصابة جسدية مثل الحروق الكيميائية ، أو متلازمات مثل مرض السكري أو التصلب المتعدد غير مدرجين في تلك الإحصاءات3. علاوة على ذلك ، لا تزال هذه الحالة غير مشخصة بشكل كبير<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتورة كارين لولييه على الوصول إلى خط الماوس المعدل وراثيا MAGIC-Markers. يشكر المؤلفون أيضا مرفق RAM-Neuro الحيواني الأساسي ومرفق التصوير بالرنين المغناطيسي ، وهو عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR-10-INBS-04 ، “الاستثمارات من أجل المستقبل”). تم دعم هذا البحث من قبل برنامج ATIP-Avenir ، Inserm ، Région Occitanie ، جامعة مونبلييه ، الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-21-CE17-0061) ، مؤسسة البحوث الطبية (FRM Regenerative Medicine ، REP202110014140) ، ومؤسسة Groupama.
Materials
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
References
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
- Dua, H. S., et al. Neurotrophic keratopathy. Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).
- Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. Neurotrophic keratitis. Eye. 17 (8), 989-995 (2003).
- Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
- Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , (2023).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
- Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
- Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
- Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
- Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
- He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
- Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
- Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. Lamellar corneal transplantation. Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
- Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
- Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
- Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
- Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
- Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. Lamellar keratoplasty techniques. Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).
- Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).
