Summary

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Abstract

A córnea é um tecido transparente que cobre o olho e é crucial para uma visão clara. É o tecido mais inervado do corpo. Essa inervação proporciona sensação e função trófica ao olho e contribui para preservar a integridade corneana. A ruptura patológica dessa inervação é denominada ceratite neurotrófica. Isso pode ser desencadeado por lesão no olho, cirurgia ou doença. Neste estudo, propomos três diferentes protocolos para causar dano à inervação de forma a recapitular os três tipos de casos geralmente encontrados na clínica.

O primeiro método consiste em fazer uma abrasão do epitélio com uma broca oftálmica. Trata-se da remoção da camada epitelial, das terminações nervosas livres e do plexo subbasal de forma semelhante à cirurgia de ceratectomia fotorrefrativa realizada na clínica. O segundo método visa apenas a inervação seccionando-a na periferia com um punch de biópsia, mantendo a integridade do epitélio. Este método é semelhante aos primeiros passos da ceratoplastia lamelar e leva a uma degeneração da inervação seguida de recrescimento dos axônios na córnea central. O último método danifica a inervação de um modelo de camundongo transgênico usando um microscópio multifóton, que localiza especificamente o local de cauterização das fibras nervosas fluorescentes. Este método inflige o mesmo dano que a fotoceratite, uma superexposição à luz UV.

Este estudo descreve diferentes opções para investigar a fisiopatologia da inervação corneana, particularmente a degeneração e regeneração dos axônios. Promover a regeneração é crucial para evitar complicações como defeitos do epitélio ou mesmo perfuração da córnea. Os modelos propostos podem ajudar a testar novas moléculas farmacológicas ou terapia gênica que melhoram a regeneração nervosa e limitam a progressão da doença.

Introduction

A córnea, que é a superfície transparente do olho, é composta por três camadas distintas: o epitélio, o estroma e o endotélio. Este órgão possui a maior densidade de inervação do corpo e é composto principalmente por fibras sensitivas (tipos Aδ e C) originárias do ramo oftálmico do gânglio trigeminal. As fibras sensoriais penetram na periferia da córnea no estroma médio na forma de grandes feixes que se ramificam para cobrir a superfície. Eles então se bifurcam para perfurar a membrana de Bowmann e formam o plexo subbasal, que é facilmente reconhecível pela formação de um vórtice no centro da córnea. Essas fibras terminam como terminações nervosas livres na superfície externa do epitélio. São capazes de transduzir estímulos térmicos, mecânicos, químicos e liberar fatores tróficos essenciais para a homeostase do epitélio 1,2. A ceratite neurotrófica (NK) é uma doença degenerativa que afeta a inervação sensorial corneana. Esta doença rara decorre de uma diminuição ou perda da sensibilidade corneana que resulta em menor produção lacrimal e pobres propriedades cicatrizantes da córnea3. A NK evolui através de três estágios bem descritos, desde o estágio 1, onde os pacientes sofrem defeitos epiteliais, até o estágio 3, onde ocorre fusão estromal e/ou perfuração corneana4.

Clinicamente, as origens desta doença podem ser diversas. Os pacientes podem perder a inervação corneana após lesão física ocular, cirurgia ou por doenças crônicas, como diabetes 5,6. Até o momento, o processo de patogênese da NK permanece pouco compreendido, e as opções terapêuticas para essa condição que ameaça a visão são muito limitadas. Portanto, um melhor entendimento das características dos defeitos epiteliais é necessário para melhor compreender os mecanismos por trás da regeneração dessas fibras e potencialmente promovê-los. Aqui, propomos vários modelos de lesão corneana que induzem NK em camundongos.

O primeiro modelo é a abrasão da camada epitelial da córnea com uma broca ocular. Esse modelo tem sido estudado principalmente no contexto da regeneração do epitélio em diferentes animais, como roedorese peixes7,8,9, e para testar moléculas promotoras da cicatrização corneana 10,11. Fisiologicamente, leva 2-3 dias para que as células epiteliais fechem a ferida. O padrão fisiológico da inervação, entretanto, leva mais de quatro semanas para se recuperar da abrasão12,13. Durante a cirurgia, a broca ocular remove a camada epitelial da córnea que contém o plexo subbasal e as terminações nervosas livres das fibras. Este procedimento pode ser clinicamente comparado a pacientes com ceratectomia fotorrefrativa (PRK) para correção de defeitos refrativos oculares. O procedimento consiste na remoção do epitélio da córnea e, em seguida, na remodelagem do estroma com laser14. Os pacientes podem apresentar vários efeitos colaterais após essa cirurgia, como diminuição da densidade do nervo corneano por 2 anos e redução da sensibilidade por um período de 3 meses a um ano após a cirurgia15. Como a cirurgia induz uma fragilidade do microambiente corneano, esse modelo poderia ajudar a investigar esses efeitos colaterais e desenvolver abordagens terapêuticas que promovessem reinervação mais rápida, reduzindo os efeitos colaterais em questão.

O segundo modelo consiste em seccionar os axônios na periferia da córnea com punch de biópsia, induzindo uma degeneração walleriana da inervação central 16. Clinicamente, esse método poderia ser comparado à ceratoplastia lamelar anterior, na qual o cirurgião realiza uma trepanação parcial da córnea para remover uma parte da espessura anterior da córnea e substituí-la por um transplante de doador 17. Após a ceratoplastia lamelar, os pacientes podem apresentar uma série de sintomas, incluindo olho seco, perda da inervação corneana e rejeição do enxerto18. Este modelo de axotomia realizada em nervos corneanos poderia fornecer informações sobre os mecanismos de degeneração das fibras, que ocorre após um enxerto, seguido pela regeneração dos axônios.

O terceiro método danifica os nervos da córnea com um laser. Utilizando-se microscópio multifóton na córnea de animais anestesiados, a degeneração dos nervos localizados no campo óptico é induzida como resultado da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que leva a danos no DNA e cavitação celular19. Esse método recapitula o fotodano corneano induzido pela superexposição aos raios UV naturais (queimaduras solares), que também desencadeiam a formação de EROs, levando a danos no DNA20. Os pacientes que sofrem de queimadura solar da córnea experimentam grande dor, pois a deterioração das células epiteliais priva as extremidades das fibras corneanas de tudo.

Os três métodos aqui descritos são projetados para permitir a investigação do processo de patogênese NK e regeneração axonal. São facilmente reprodutíveis e precisos. Além disso, permitem rápida recuperação e fácil monitoramento dos animais.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo National Animal Experiment Board. 1. Preparações Preparar uma solução anestésica de ketamina-xilazina para anestesia. Injetar cetamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluindo 200 μL de cetamina (100 mg/mL) e 125 μL de xilazina (20 mg/mL) em 2.175 mL de NaCl 0,9% estéril. Preparar 0,02 mg/mL de solução de buprenorfina como solução analgésica adicionando 100 μL de buprenorfina a 0,3 mg/mL a 1.400 mL d…

Representative Results

Este estudo propõe vários protocolos para causar danos à inervação corneana em camundongos. Embora protocolos semelhantes tenham sido utilizados para investigar a fisiopatologia da cicatrização do epitélio, optamos por adaptar e desenvolver novos métodos de investigação da regeneração da inervação corneana. Para a observação da inervação, foram utilizadas duas técnicas. Primeiro, empregamos uma técnica de imunofluorescência para corar as fibras nervosas usando um anticorpo pan-neuronal (tubulina BII…

Discussion

A ceratite neurotrófica é considerada uma doença rara, afetando 5 em cada 10.000 indivíduos. No entanto, pessoas que sofrem de NK devido a uma lesão física, como queimaduras químicas, ou síndromes, como diabetes ou esclerose múltipla, não são incluídas nessasestatísticas3. Além disso, essa condição permanece significativamente subdiagnosticada22, e a prevalência da doença é subestimada. Há uma forte necessidade de novos tratamentos e terapias que promova…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem à Dra. Karine Loulier pelo acesso à linhagem de camundongos transgênicos MAGIC-Markers. Os autores também agradecem à instalação do núcleo animal RAM-Neuro e à instalação de imagem MRI, um membro da infraestrutura nacional France-BioImaging apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR-10-INBS-04, “Investimentos para o futuro”). Esta pesquisa foi apoiada pelo programa ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, Universidade de Montpellier, Agência Nacional de Pesquisa da França (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) e Groupama Foundation.

Materials

0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium

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Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).

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