本方案提供了利用套管技术在小鼠原位肝移植中进行血管重建的技术信息。
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摘要
摘要
小鼠原位肝移植是研究肝脏缺血再灌注损伤机制的有效方法。然而，该技术操作难度较高，限制了这一重要实验模型的应用及其技术向新一代研究人员的传承。该手术最具挑战性的环节是血管重建，包括门静脉（PV）、肝下下腔静脉（IHIVC）和肝上下腔静脉。采用塑料套管代替缝线，可使PV和IHIVC的重建过程更为顺畅。血管重建通过将由静脉留置针制成的套管连接至移植物血管断端，并将套管插入受体血管内完成。其中最关键的两个要点是：充分显露血管内腔以及避免施加过大外力。本研究旨在提供受体手术中使用套管技术进行血管重建的技术概述。这些关于套管技术的操作要点有望帮助显微外科医生更顺利地完成血管重建，推动相关研究的进展。
引言
小鼠原位肝移植（MOLT）是一种有效的实验方法，最早于1991年报道1。该实验模型利用基因修饰小鼠和多种研究试剂，在研究肝脏缺血再灌注损伤（包括热缺血和冷缺血）方面发挥了关键作用。然而，由于该模型技术复杂度高，限制了肝移植基础医学的发展2。MOLT主要包括三个步骤：（1）从供体小鼠中获取肝脏，（2）修肝手术，（3）将肝脏植入受体小鼠体内。在这些受体操作中，血管吻合是最具挑战性的环节。通常，肝上段下腔静脉吻合采用手工缝合完成2，而肝下段下腔静脉（IHIVC）和门静脉（PV）则可使用塑料套管替代手工缝合，从而更高效地完成重建。
无肝期是指受体自身肝脏被切除至移植肝植入之间的间隔时间。为确保实验结果的一致性，必须将无肝期控制在20分钟以内。因此，采用此模型的研究仅限于少数特定机构3,4,5,6,7,8,
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方案
实验方案经京都大学动物实验委员会批准。研究使用了来自商业来源的C57BL/6小鼠（参见材料表），年龄超过10周，体重在25 g至30 g之间。所有动物均采用2.5%异氟烷进行麻醉（遵循机构批准的方案），饲养于特定病原体-free环境中，所有实验操作均符合京都大学《动物实验条例》。本研究使用的关键仪器列于材料表中，并在图1和图2中展示。
1. 动物选择
- 使用体重为25-30 g的小鼠。
注意：尽管小鼠肝脏同种异体移植2通常可跨越主要组织相容性复合体屏障被接受，但本研究选择使用同基因型MOLT模型，以专注于冷缺血再灌注损伤机制的详细研究10。不建议使用体重低于25 g的小鼠，因为无法将内支架插入较细的胆管。同样，也不建议使用体重超过30 g的小鼠，因其血管周围存在大量腹腔脂肪。
2. 套管制作
- 准备用于门静脉（PV）和经肝内静脉肝内静脉通路（IHIVC）的20 G和16 G静脉导管。
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结果
当门静脉去夹闭后无扭曲且肝脏灌注均匀时，门静脉重建即为成功。无肝期应少于20分钟，因为无肝期超过25分钟会增加小鼠死亡风险。若移植物无血液反流，则下腔静脉重建视为成功。
使用器官保存液在低温条件下保存移植物1小时后，再灌注6小时时血清丙氨酸氨基转移酶水平约为2,000 U/L（图7A）。移植后7天的存活率为100%（图7B）。然而，在我们未进行肝动脉吻合的模型中，受体小鼠可能在移植后约30天因肝内胆汁瘤相关问题而死亡
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讨论
学习血管重建是成功实施MOLT最具挑战性的环节。由于小鼠血管尺寸较小，套管的质量会显著影响重建的难度5。本文提供了一套关于套管制备、安装及重建的详细操作方案。
尽管在套管制备和连接方面与以往的报道相比没有显著差异2,5，但仍需注意一些细微之处。首先，套管手柄的厚度应控制在套管总周长的约1/6左右。若手柄过薄，则容易弯曲且难以抓握；若过厚，则在受体动物腹腔内操作时可能不便。早期明确个人操作偏好至关重要。
其次，背桌操作时对管腔的可视性至关重要。使用一根10-0尼龙线，将其连接至供体脾静脉作为标志，以确认门静脉（PV）管腔的位置。尼龙线应置于8点钟位置，以防止过度扭转。用两把镊子分别夹住血管壁的3点钟和9点钟位置，并将其压向套管壁的6点钟位置，从而将血管壁外翻。使用8-0丝线进行固定时需动作轻柔。通过将血管壁牢固地固定于套管凹槽内，即可实现充分固定。完成连接后，提起套.......
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披露
所有作者均无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由2022年日本移植学会基础研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16 G 静脉导管 | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC 套管 |
| 20 G 静脉导管 | TERUMO | SR-FF1651 | PV 套管 |
| 8-0 编织丝线 | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 丝线 |
| Belzer UW 冷保存液 | Astellas | 器官保存液 | |
| 血管夹钳（Bulldog钳） | B BRAUN | FB329R | 血管夹钳（Bulldog钳） |
| C57BL/6 小鼠 | Oriental Bio Service | ||
| 异氟烷吸入溶液 | Viatris | 麻醉剂 | |
| 微细钝头镊尖 0.1 mm × 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | 直头显微镊 |
| 带锁微血管夹施夹器 | F.S.T | 18056-14 | 血管夹施夹器 |
| 微血管夹（Micro Serrefines） | F.S.T | 18055-4 | 血管夹 |
| No.11 备用刀片 | FEATHER Safety Razor | 11 | 刀片 |
| 眼科剪，圆柄 | B BRAUN | FD103R | 显微剪 |
| 塑料矩形容器 | Daiso | 长 10 cm，宽 15 cm，高 6 cm | |
| SuperGrip 镊尖 | F.S.T | 00649-11 | 弯头显微镊 |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | 显微镜 |
| 台钳 | Niigataseiki | 00505351 | 用于将 Pean 钳固定在桌面上的机械工具 |
参考文献
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Na....
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重印与许可
