Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66238

⸱

19 januari 2024

 , 
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

Samenvatting

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een sleutelrol bij de regulatie van het cellulaire metabolisme in fysiologische en pathologische processen. Fysiologische ROS-productie speelt een centrale rol in de ruimtelijke en temporele modulatie van normale cellulaire functies zoals proliferatie, signalering, apoptose en senescentie. Chronische ROS-overproductie daarentegen is verantwoordelijk voor een breed spectrum aan ziekten, zoals onder andere kanker, hart- en vaatziekten en diabetes. Het kwantificeren van ROS-niveaus op een nauwkeurige en reproduceerbare manier is dus essentieel voor het begrijpen van de normale cellulaire functionaliteit. Op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde methoden om intracellulaire ROS-soorten te karakteriseren is een veelgebruikte benadering. Veel van de ROS-protocollen voor beeldvorming in de literatuur gebruiken 2'-7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleurstof. Deze kleurstof heeft echter aanzienlijke beperkingen in het gebruik en de interpreteerbaarheid. Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een dihydroethidium (DHE) fluorescentiesonde als een alternatieve methode om de totale ROS-productie in een high-throughput omgeving te kwantificeren. Het high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, werd gebruikt om de ROS-productie te meten en te kwantificeren. Deze studie werd uitgevoerd in drie hepatocellulaire kankercellijnen - HepG2, JHH4 en HUH-7. Dit protocol geeft een diepgaande beschrijving van de verschillende procedures die betrokken zijn bij de beoordeling van ROS in de cellen, waaronder: bereiding van DHE-oplossing, incubatie van cellen met DHE-oplossing en meting van DHE-intensiteit die nodig is om de ROS-productie te karakteriseren. Dit protocol toont aan dat DHE fluorescerende kleurstof een robuuste en reproduceerbare keuze is om intracellulaire ROS-productie op een high-throughput manier te karakteriseren. Benaderingen met een hoge doorvoer om de ROS-productie te meten, zijn waarschijnlijk nuttig in een verscheidenheid aan onderzoeken, zoals toxicologie, drugsscreening en kankerbiologie.

Inleiding

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn een groep van natuurlijk voorkomende, zeer reactieve en tijdelijk onstabiele chemische radicalen die worden gevormd als onderdeel van het normale cellulaire metabolisme in cellen. ROS speelt een belangrijke en essentiële rol bij de modulatie van normale fysiologische en biochemische processen die plaatsvinden in cellen 1,2. De belangrijkste bron van ROS-productie in cellen is afkomstig van de mitochondriale elektronentransportketen (ETC)-route als onderdeel van de normale bio-energetische cyclus. Belangrijke aanvullende bronnen van ROS-productie zijn enzymatische reacties zoals cellulaire NADPH-oxidasen in cellen. Het metabolisme van voedselmoleculen (bijv. glucose) vindt plaats via de oxidatieve fosforyleringsroute in de mitochondriale matrix. Een basisniveau van ROS-productie is essentieel om normale fysiologische celsignaleringsprocessen te reguleren. Van veel belangrijke eiwitmoleculen die deel uitmaken van de glucosemetabole signaleringsroutes (bijv. Akt en PTEN) is bekend dat ze reageren op intracellulaire ROS-niveaus. Bovendien worden ROS geproduceerd door verschillende intracellulaire enzymen zoals xanthine-oxidase, stikstofmonoxidesynthase en peroxisomale bestanddelen als onderdeel van de cellulaire enzymatische routes 1,2. In tegenstelling tot de natuurlijke bronnen van ROS, leiden bepaalde omgevingsfactoren, zoals xenobiotica, infectieuze agentia, UV-licht, vervuiling, het roken van sigaretten en straling, ook tot overmatige productie van ROS, die een belangrijke oorzaak zijn van intracellulaire oxidatieve stress 1,3. Verhoogde cellulaire oxidatieve stress kan schade veroorzaken aan natuurlijke biomoleculen in een cel, zoals lipiden, eiwitten en DNA, en verschillende ziekten veroorzaken, zoals kanker, diabetes, hart- en vaatziekten, chronische ontstekingen en neurodegeneratieve aandoeningen 1,3,4. Daarom zijn nauwkeurige metingen van ROS essentieel om de cellulaire mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van oxidatieve stress-geïnduceerde ziekten.

Vanwege de korte tijdschalen van ROS-productie en -eliminatie in cellen, blijven kwantitatieve metingen van verschillende ROS-radicalen een uitdaging. Methoden zoals elektronenparamagnetische resonantie (EPR)5, hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en beeldvorming op basis van fluorescentiesondes worden gebruikt om de verschillende cellulaire ROS6 te meten. Hoewel methoden zoals EPR en HPLC kwantitatief nauwkeurige schattingen opleveren, omvatten deze methoden de vernietiging van de cellulaire ruimtelijke morfologie en zijn ze meestal in de vorm van globale en bulkmetingen van een monster. Daarentegen behouden op beeldvorming gebaseerde methoden, zoals op fluorescentiesondes gebaseerde methoden, de cellulaire morfologie en ruimtelijke context van de ROS-generatie. De specificiteit van verschillende fluorescentiesondes voor verschillende soorten ROS-radicalen is echter niet goed vastgesteld 7,8. Verschillende fluorescerende sondes zoals dihydroethidium (DHE), dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethylantraceen (DMA), 2,7-dichloordihydrofluresceïne (DCFH), 1,3-difenylisobenzofuraan (DPBF) en MitoSox zijn commercieel beschikbaar voor ROS-detectie. In de afgelopen decennia zijn DHE, MitoSox en DCFH-DA de meest gebruikte fluorescerende kleurstoffen om ROS in cellen en weefsels te meten 8,9. DCFH-DA is een veelgebruikte kleurstof voor het detecteren van intracellulaireH2O2 en oxidatieve stress. Ondanks de populariteit van DCFH-DA, hebben meerdere eerdere onderzoeken aangetoond dat het niet betrouwbaar kan worden gebruikt om intracellulaire H2O2 en andere ROS-niveaus 8,9,10,11,12,13,14 te meten.

De fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) daarentegen vertoont een specifieke respons op de intracellulaire superoxideradicaal (O2-). Hoewel het superoxideradicaal een van de vele ROS-soorten is die in cellen worden waargenomen, is het een belangrijk radicaal dat betrokken is bij de vermindering van overgangsmetalen, omzetting in peroxynitraat en de vorming van hydroperoxiden, naast andere intracellulaire effecten. DHE wordt snel opgenomen door de cellen en heeft een fluorescentie-emissie in het rode golflengtebereik15. Bij reactie met specifiek superoxideradicaal vormt DHE een rood fluorescerend product, 2-hydroxy-ethidium (2-OH-E+). DHE kan dus worden beschouwd als een specifieke sonde voor de detectie van superoxide. DHE kan echter ook niet-specifieke oxidatie ondergaan met ONOO- of OH., H2O2 en cytochroom c om een tweede fluorescentieproduct te vormen, ethidium E+, dat de gemeten 2-OH-E+-niveaus kan verstoren. Deze 2-OH E+ en E+ producten, in combinatie, vertegenwoordigen echter een groot deel van de totale cellulaire ROS-soorten die in een cel worden waargenomen wanneer ze worden gekleurd met DHE. E+ intercaleert in DNA, waardoor de fluorescentie ervan aanzienlijk wordt verbeterd 8,9,10,11,13,14,15,16. Aangezien de fluorescentiespectra van ethidium en 2-hydroxyethidium slechts in geringe mate verschillen, kan de meerderheid van de ROS-niveaus die worden waargenomen in een cel secundair aan superoxideproductie worden gedetecteerd en gemeten met behulp van DHE-fluorescentieproducten. Deze ROS-soorten worden geïdentificeerd met behulp van 480 nm golflengte-excitatie en 610 nm golflengte-emissie 15,16,17.

Naast het kiezen van een specifieke fluorescerende ROS-detectiesonde, is het belangrijk om een gevoelige detectiemethode te kiezen om intracellulaire ROS te meten. Nauwkeurige beoordeling van intracellulaire ROS-niveaus is dus de sleutel tot het identificeren van verstoorde redoxbalanstoestanden die optreden in zieke cellen of cellen die zijn blootgesteld aan verschillende omgevingsstressoren zoals straling, toxicologische verbindingen en genotoxische agentia18. Aangezien ROS een veel voorkomend fenomeen is in cellen dat verantwoordelijk is voor het reguleren van een verscheidenheid aan celsignaleringsactiviteiten, zijn robuuste detectiemethoden van ROS essentieel. Om een dergelijke high-throughput evaluatie van de ROS-productie in cellen mogelijk te maken, maakt dit protocol gebruik van een high-content screening (HCS)-platform om de ROS-soorten te meten. Het huidige protocol maakt de high-throughput analyse van intracellulaire ROS-productie mogelijk, wat van cruciaal belang is in veel toxicologische studies19. Dit protocol heeft tot doel een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden voor het detecteren en meten van intracellulaire ROS in aanhangende hepatocellulaire carcinoomcellen. De chemische reagentia vanH2O2 en menadion worden gebruikt als krachtige ROS-stimulatoren om de relatieve niveaus van ROS-productie te meten in een gecontroleerde omgeving met hoge doorvoer. Dit protocol kan worden verfijnd om de ROS-productie in aanhangende en niet-aanhangende cellen onder passende omstandigheden te meten, indien nodig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek

  1. Zaai de testcellen (HepG2-, HUH7- en JHH4-hepatocellulaire carcinoomcellen) in een plaat met 96 putjes met een zaaidichtheid van 10.000 cellen/putje in een uiteindelijk zaaivolume van 200 μL per putje.
    1. Voordat u de HepG2-cellen kweekt, smeer u de 96 plaatputjes in met type IV collageen (50 μg/ml) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Om stolling van het collageen te voorkomen, plaatst u de stockoplossing in ijs en start u vervolgens het verdunningsproces tot de gewenste concentratie.
    2. Na een incubatietijd van 2 uur het overtollige collageen afzuigen en de putjes drie keer wassen met de 1x PBS.
  2. Kweek de cellen 's nachts in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) bij 37 °C en 5% CO2 - concentratie in een bevochtigde incubator.
  3. Behandel de cellen de volgende dag, of bij het bereiken van de 80%-90% confluentie, afhankelijk van wat zich het eerst voordoet, de cellen met respectievelijk H2O2 (onbehandeld, 250 μM, 500 μM, 750 μM en 1000 μM) en Menadion (onbehandeld, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) om de representatieve oxidatieve stress te induceren.
  4. U kunt er ook voor kiezen om de cellen te testen met de gewenste teststof naar keuze die oxidatieve stress in de cellen kan veroorzaken.

2. Bereiding van de voorraad- en verdunde oplossing voor DHE-kleuring van cellen

  1. Bereid DHE-voorraadoplossing (5 mg/ml of 15,9 mM) door 5 mg DHE op te lossen in 1 ml DMSO.
  2. Verdun de DHE-stockoplossing met dubbel gedestilleerd geautoclaveerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM.
  3. Om het bevriezings- en dooiproces van de kleurstof te voorkomen (wat de fluorescentie-eigenschappen na verloop van tijd kan beschadigen), bereidt u verschillende aliquots in centrifugebuisjes van 1,5 ml met een concentratie van 100 μM en bewaart u deze bij -20 °C.
  4. Om een uiteindelijke werkconcentratie van 10 μM te bereiken, gebruikt u een aliquot van de DHE-concentratie van 100 μM en verdunt u deze met voorverwarmde DMEM-media.
    OPMERKING: De werkoplossing moet op de dag van het experiment vers worden bereid.
  5. Draai de werkende fluorescentiekleurstofoplossing gedurende 5-10 s om een goede menging van de kleurstof te garanderen.

3. DHE-kleuringsproces

  1. Verwijder het medium dat het geneesmiddel of de teststof bevat uit elk putje en was het voorzichtig één keer met 1x PBS of DMEM.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van de additie- of wasstappen in het experiment is het van cruciaal belang om direct contact tussen de cellen en de pipettor te vermijden. Dit kan worden bereikt door de PBS voorzichtig langs de zijkanten van de putten te pipetteren om mogelijke mechanische schade aan de cellen te minimaliseren. Door ervoor te zorgen dat de pipettor de cellen niet rechtstreeks raakt, blijft de integriteit en levensvatbaarheid van de cel behouden voor de duur van het experiment.
  2. Voeg 100 μL DMEM-media met 10 μM DHE (werkoplossing) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  3. Verwijder na een incubatietijd van 30 minuten de DHE-bevattende media en was elk putje drie keer voorzichtig met de 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dit kan worden uitgevoerd met een meerkanaals pipettor om een snelle doorlooptijd te garanderen.
  4. Voeg 200 μL 1x PBS toe aan elk putje met Hoechst 33342 nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten bij RT.
  5. Verwijder de Hoechst 33342 nucleaire kleuringsoplossing uit het putje en voeg 200 μL 1x PBS toe aan elk putje.
    OPMERKING: Om vaste cellen te verkrijgen, volgt u hetzelfde protocol als voor de levende cellen, met een extra stap van het toevoegen van 4% PFA gedurende 5 minuten na de behandeling en DHE-kleuring. Verwijder de PFA-oplossing en was de cellen met de 1x PBS. Incubeer vervolgens de cellen met de nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten.
  6. Verplaats de plaat zo snel mogelijk naar het screeningplatform met hoge inhoud, fluorescentiemicroscopie of plaatlezer voor beeldacquisitie.

4. Beeldacquisitie en intensiteitsmeting

  1. Plaat laden
    1. Open de Cellomics CX7 high-content screening (HCS) software voor data-acquisitie.
    2. Kalibreer het beeldvormingsplatform zorgvuldig van tevoren volgens de specificaties van de fabrikant met de specifieke plaat met 96 putjes naar keuze voor gebruik om wazige of wazige beelden in de gegevens te voorkomen.
      OPMERKING: Multi-well-platen van verschillende leveranciers kunnen verschillende materiaaleigenschappen hebben en kunnen de kwaliteit van de verkregen uiteindelijke afbeeldingen beïnvloeden.
    3. Eenmaal gekalibreerd, slaat u de systeemparameters die specifiek zijn voor het plaatmerk op in de instrumentendatabase en gebruikt u ze opnieuw voor toekomstige gegevensacquisities.
    4. Plaats de plaat met de voorbereide monsters voorzichtig op de verwarmde tafel van het HCS-beeldvormingssysteem. Zorg ervoor dat de plaat stevig en in de juiste richting is geplaatst voor beeldvorming op de microplaathouder (d.w.z. zoek het label gemarkeerd met A1 op de lezertafel en draai vervolgens de microplaat zodat de locatie van putje A1 overeenkomt met de hoek met de sticker).
    5. Druk voorzichtig op de microplaat om ervoor te zorgen dat deze plat tegen de tafel rust. Ongelijkmatige nivellering van de plaat in het HCS-systeem kan leiden tot fouten in de beeldacquisitie.
    6. Nadat de plaat op zijn plaats zit, houdt u de Ctrl-toets ingedrukt en klikt u vervolgens op Ctrl-OK in het dialoogvenster Plaat laden/lossen in de software.
  2. Beeldvormingsparameters selecteren
    1. Open in het HCS-beeldvormingssysteem de Target Activeringsmodus in de Cellomics-interface voor biotoepassingen en maak een nieuw protocol met behulp van het tweekanaals installatieprotocol dat compatibel is met (a) nucleaire kleuring en (b) DHE-fluorescentiesondegegevensverzameling. In het huidige protocol werden de filters 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS en 386_BGS_RS gebruikt voor respectievelijk (a) Hoechst 33342 nucleaire kleuring, (b) totale ROS-productie en (c) detectie van superoxideradicalen. De keuze voor deze filters werd ingegeven door de specifieke overlap voor de emissie-eigenschappen van elke kleurstof (DAPI en DHE) die als onderdeel van dit protocol wordt gebruikt.
      OPMERKING: De naamgevingsconventie van filters, bijv. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, verwijst naar de excitatie van het monster met 386 nm licht met een bandbreedte van 23 nm, gevolgd door een dichroïsch filter dat blauw (B), groen (G), rood (R), verrood (FR) en nabij-infrarood (N) licht doorlaat op specifieke golflengtebereiken en de 386_BGS_RS verwijst naar een emissiefilter dat BGS- en RS-emissiegolflengtelicht doorlaat na het dichroïsch.
    2. Specificeer indien nodig de doelstellingen voor het beeldacquisitieproces binnen de softwareprotocolinterface, zoals 10x of 20x vergroting.
    3. Kies de juiste objectiefvergroting, afhankelijk van het gewenste detailniveau en de resoluties die nodig zijn voor het experiment. De resolutie van elk doel staat echter vast. Bij een hogere resolutie moet het doel op het platform worden vervangen. In het huidige protocol wordt een 20x, 0,45 NA-doelstelling gebruikt, die deel uitmaakt van het high-content screeningplatform dat in dit protocol wordt gebruikt.
      OPMERKING: Het 20x-objectief vertegenwoordigt een goede afweging tussen details van de beeldresolutie en de snelheid van acquisitie die nodig is om ROS-veranderingen in de loop van de tijd vast te leggen. Er kunnen objectieven met een hogere vergroting worden gekozen (bijv. 40X), maar dit zal leiden tot langere acquisitietijden.
    4. Specificeer de belichtingsinstellingen van de beeldacquisitiecamera, zoals de belichtingstijd, camerabinning en z-stack-interval, volgens de specifieke vereisten van het protocol.
      OPMERKING: De belichtingstijd (vaak in milliseconden) varieert op basis van de signaalsterkte en gevoeligheid van de specifieke fluoroforen die worden gebruikt. Dit kan ook enigszins verschillen van experiment tot experiment op basis van de kleurstofconcentratie en kleurkwaliteit. In het huidige protocol zijn de parameters van acquisitie als volgt vastgesteld: doel% - 35%, beeldacquisitiemodus - 1104 x 1104 (met 2x2 binning) en objectief 20x, 0,45 NA. Deze parameters kunnen worden ingesteld op basis van de specifieke experimentele omstandigheden.
  3. Configuratieparameters voor beeldvorming
    OPMERKING: Zodra de beeldvormingsparameters zijn ingesteld, kan het beeldverzamelingsproces worden gestart met behulp van de software-interface.
    1. Parameters voor beeldverzameling
      1. Identificeer het primaire volgobject van belang (de kern van de cellen) met behulp van verschillende algoritmen die beschikbaar zijn in het instrument (optica - isodata, vast en driehoek).
        OPMERKING: In dit protocol wordt de isodata-methode gebruikt voor de identificatie en markering van het primaire object.
      2. Segmenteer het object (indien aanwezig) op vorm of intensiteitsparameter.
      3. Valideer het primaire object op basis van de gewenste grootte, vorm en intensiteitsparameters die uniek zijn voor elk celtype.
      4. Definieer vervolgens de 'regio van belang' (ROI) rond dit primaire object.
        OPMERKING: De ROI is een belangrijke parameter voor gegevensverzameling die de locatie definieert waar de intensiteit van de fluorescentiekleurstof wordt geïdentificeerd als consistent en herhaalbaar voor alle celtypen. De ROI definieert de belangrijkste parameters (zoals de intensiteit van de kleurstof), die worden gemeten voor elk primair volgobject (d.w.z. een cel) in verschillende kanalen van het instrument. De ROI kan worden gedefinieerd in de vorm van een cirkel of ring rond de kern van elke cel. De HCS-software verkrijgt automatisch de intensiteit van de DHE-fluorescentiekleurstofmarker in kanaal 2 binnen de limiet van de ROI voor elke cel die op een geautomatiseerde manier wordt gesegmenteerd en geanalyseerd.
      5. Stel een cirkel van 20 μm in rond het primaire object (kern). De afstand van 20 μm werd in deze studie gekozen op basis van de geschatte grootte van de verschillende cellijnen die in dit protocol worden gebruikt (HepG2, JHH-4 en HUH-7). De ring-ROI van 20 μm rond de cellen verkreeg de fluorescentie-intensiteit op een consistente en herhaalbare manier.
        OPMERKING: De belangrijkste parameter bij het kiezen van een ROI is het vermogen om het celgebied adequaat te bestrijken; de grootte van de circulaire ROI is afhankelijk van de celgrootte. Grotere cellen kunnen een grotere ROI vereisen en vice versa voor een kleinere ROI. Deze parameters moeten van tevoren worden bepaald voor elk celtype en elke fluorescentiekleurstof die van belang is.
  4. Populatiekarakterisering en geselecteerde functies om op te slaan
    1. Zodra de verschillende acquisitieparameters zijn gedefinieerd in het HCS-beeldvormingsprotocol, stelt u het HCS-systeem in de data-acquisitiemodus.
    2. De beeldacquisitieparameters voor dit protocol zijn als volgt ingesteld: een scanlimiet van 1000 cellen/put, met een minimumvereiste van 10 objecten (cellen) per veld.
      OPMERKING: Het aantal velden dat voor elk putje is beoordeeld, is bepaald op basis van het uiteindelijke aantal cellen dat het aantal 1000 bereikt. Het HCS-systeem blijft verschillende locaties in de put doorzoeken totdat het de doelpopulatie van 1000 cellen/put heeft bereikt. De acquisitiesnelheid hangt dus af van de samenvloeiing en het totale aantal cellen dat aanwezig is in elk putje van de plaat met 96 putjes. In het huidige protocol werden de totale en gemiddelde intensiteit van kanaal 2 (die de superoxideradicalen en de totale ROS-productie vertegenwoordigen) uit elke put verzameld voor verdere stroomafwaartse analyses.
  5. Beeldopname, -verwerking en -analyse
    1. Nadat u de parameters voor beeldacquisitie hebt aangepast en voltooid, start u het scanproces voor elke plaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Het Cellomics CX7-beeldvormingssysteem maakt screening met een hoog gehalte en geautomatiseerde analyse van monsters van verschillende parameters mogelijk, waaronder ROS-productie in cellen op een manier met hoge doorvoer. Naast de ROS-productie is het HCS-systeem in staat om aanvullende waardevolle informatie te verstrekken over verschillende parameters, zoals celmorfologie, subcellulaire lokalisatie en vele andere cellulaire kenmerken die van belang zijn. Eenmaal geoptimaliseerd voor acquisitie, maakt het HCS-beeldvormingsplatform uitgebreide, kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van celparameters op een robuuste manier mogelijk.
    2. Nadat het scanproces is voltooid, start u de View Analysis-software en exporteert u de verschillende kwantitatieve gegevensparameters in een .csv formaat voor aanvullende analyse.
    3. Kopieer en plak met behulp van software van derden de verschillende kwantitatieve waarden die van belang zijn voor aanvullende downstream-analyses.
      OPMERKING: In het huidige protocol werd GraphPad Prism-software gebruikt om de DHE-intensiteitswaarden te analyseren als reactie op geïnduceerde oxidatieve stress als gevolg van blootstelling aan H2O2 en menadion.
  6. Gegevens en statistische analyse
    1. Bereken de gemiddelde gemiddelde intensiteit van kanaal 2 (die de totale ROS-waarden en superoxideradicalen weergeeft).
      OPMERKING: Alle experimenten om de intensiteitswaarden te berekenen werden drie keer herhaald met 6 replicaten per toestand op elk doseringsniveau.
    2. Voer eenrichtings-ANOVA of t-test uit om de verschillen in de intensiteitswaarden tussen verschillende testomstandigheden te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dihydroethidium (DHE) is een superoxide-responsieve fluorescentiekleurstof die specifieke informatie geeft over de intracellulaire ROS-toestanden. DHE-kleurstof zendt intrinsiek blauwe fluorescentie uit in het cytoplasma. Bij interactie met superoxideradicalen wordt het echter omgezet in 2-hydroxyethidium, dat fluorescentie uitzendt in de rode golflengten (>550 nm) (Figuur 1). DHE-kleurstof wordt gemakkelijk naar de cellen en de kern getransporteerd. De uitgezonden fluorescentie kan worden g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie werd een protocol opgesteld om de productie van superoxide-gedreven intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te beoordelen met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof op een screeningsysteem met een hoog gehalte. Een meerderheid van de huidige protocollen die in de literatuur beschikbaar zijn, gebruiken de DCFH-DA als een fluorescentiebeeldvormingssonde om ROS-soorten te kwantificeren. Meerdere onderzoeken hebben echter aangetoond dat de DCFH-DA geen ideale sonde is voor het meten va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

RK en RRG werden ondersteund door een subsidie van het UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) via NIH NIGMS-subsidie P20 GM130422. RRG werd ondersteund door een pilotprijs van de NM-INSPIRES P30-subsidie 1P30ES032755. De ondersteuning van de beeldvormingskern voor het CX7 Cellomics-instrument werd geleverd via de AIM-centrumkernen die werden gefinancierd door NIH-subsidie P20GM121176. We willen Dr. Sharina Desai en Dr. Li Chen bedanken voor hun onschatbare hulp bij technische problemen met betrekking tot het gebruik van het CX7 Cellomics-beeldvormingsplatform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersie 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

Referenties

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407(2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075(2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71(2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Dihydroethidium-fluorescentieIntracellulaire ROS-metingHepatocellulaire CarcinoomcellenFluorescentiebeeldvormingToxicologische ScreeningSuperoxidedetectieCellomics CX7Geneesmiddelenscreening
High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.