Измерение бактериальной колонизации корнями Arabidopsis thaliana в гидропонном состоянии
Summary
Колонизация ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR) в ризосфере, имеет важное значение для ее стимулирующего рост эффекта. Необходимо стандартизировать метод выявления бактериальной ризосферной колонизации. Здесь мы описываем воспроизводимый метод количественной оценки бактериальной колонизации на поверхности корня.
Abstract
Измерение бактериальной колонизации корня Arabidopsis thaliana является одним из наиболее частых экспериментов в исследованиях взаимодействия растений и микробов. Стандартизированный метод измерения бактериальной колонизации в ризосфере необходим для улучшения воспроизводимости. Сначала мы культивировали стерильную A.thaliana в гидропонных условиях, а затем инокулировали бактериальные клетки в ризосфере при конечной концентрации OD600 0,01. Через 2 дня после инокуляции ткань корня собирали и трижды промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Затем корни взвешивали, и бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали вихрем. Клеточную суспензию разбавляли градиентом с фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующим нанесением на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 10 часов, а затем подсчитывали и нормализовали единичные колонии на LB-планшетах, чтобы указать на бактериальные клетки, колонизированные на корнях. Этот метод используется для обнаружения бактериальной колонизации в ризосфере в условиях моновзаимодействия, с хорошей воспроизводимостью.
Introduction
Существуют количественные и качественные методы выявления колонизации ризосферы одним штаммом бактерий. Для качественного метода следует использовать штамм, который конститутивно экспрессирует флуоресценцию, а распределение и интенсивность флуоресценции следует исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии или лазерных конфокальных инструментов 1,2. Эти стратегии могут хорошо отражать бактериальную колонизацию in situ3, но они не так точны, как традиционные методы подсчета планшетов при количественной оценке. Кроме того, из-за ограничения отображения под микроскопом только частичных корневых зон, иногда на него может влиять субъективная систематическая ошибка.
Здесь мы опишем количественный метод, который включает в себя сбор колонизированных бактериальных клеток и подсчет бактериальных КОЕ на планшете. Этот метод основан на разбавлении и покрытии, с помощью которых можно подсчитать колонизированные штаммы, которые были удалены из корней растений, и можно вычислить общее количество колонизированных бактерий на корне 4,5.
Сначала A. thaliana культивировали в гидропонных условиях, а затем бактериальные клетки инокулировали в ризосферу в конечной концентрации 0,01 OD600. Инфицированные корневые ткани собирали через 2 дня после инокуляции и промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Далее бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали, разбавляли в буфере с фосфатно-солевым буфером (PBS) и помещали на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). После инкубации при 37 °С в течение 10 ч подсчитывали и нормализовали единичные колонии на ЛБ-планшетах для определения бактериальных клеток, колонизированных на корнях.
Этот метод очень применим, имеет хорошую повторяемость и больше подходит для точного определения ризосферной колонизации бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для достижения хорошей воспроизводимости существует четыре критических шага для процесса обнаружения колонизации этого протокола. Во-первых, необходимо убедиться, что количество инокулированных клеток бактерий в каждом эксперименте одинаково. Во-вторых, также необходим контроль ин?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (32370135), Инновационной программой Китайской академии сельскохозяйственных наук (CAAS-CSAL-202302), Научно-техническим проектом Цзянсуского профессионального колледжа сельского и лесного хозяйства (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
