מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני
Summary
התיישבות של ריזובקטריה מעודדת גדילה של צמחים (PGPR) בריזוספרה חיונית להשפעתו מעודדת הצמיחה. יש צורך לתקנן את שיטת הזיהוי של התיישבות ריזוספרה חיידקית. במאמר זה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור לכימות התיישבות חיידקים על פני השטח של השורש.
Abstract
מדידת התיישבות חיידקים על שורש Arabidopsis thaliana היא אחד הניסויים השכיחים ביותר במחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרובים. שיטה סטנדרטית למדידת התיישבות חיידקים בריזוספרה נחוצה כדי לשפר את יכולת הרבייה. תחילה תרבינו A.thaliana סטרילית בתנאים הידרופוניים ולאחר מכן חיסנו את תאי החיידק בריזוספרה בריכוז סופי של OD600 של 0.01. יומיים לאחר החיסון, רקמת השורש נקטפה ונשטפה שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. לאחר מכן נשקלו השורשים, ותאי החיידק שהתיישבו על השורש נאספו על ידי מערבולת. מתלה התא דולל בשיפוע עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS), ואחריו ציפוי על תווך אגר לוריא-ברטאני (LB). הצלחות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, ולאחר מכן, המושבות הבודדות על לוחות LB נספרו ונורמלו כדי לציין את תאי החיידקים שהתיישבו על שורשים. שיטה זו משמשת לזיהוי התיישבות חיידקים בריזוספרה בתנאי מונו-אינטראקציה, עם יכולת שחזור טובה.
Introduction
קיימות שיטות כמותיות ואיכותיות לאיתור התיישבות ריזוספרה על ידי זן חיידק יחיד. בשיטה האיכותית יש להשתמש בזן המבטא פלואורסצנטיות באופן מכונן ולבחון את התפלגות הפלואורסצנטיות ועוצמתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מכשירי לייזר קונפוקליים 1,2. אסטרטגיות אלה יכולות בהחלט לשקף התיישבות חיידקים באתרו3, אך הן אינן מדויקות כמו שיטות ספירת לוחות מסורתיות בכימות. חוץ מזה, בגלל המגבלה של הצגת אזורי שורש חלקיים בלבד מתחת למיקרוסקופ, לפעמים זה יכול להיות מושפע מהטיה סובייקטיבית.
במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית, הכוללת איסוף תאי החיידק המאוכלסים וספירת ה-CFUs החיידקיים על צלחת. שיטה זו מבוססת על דילול וציפוי שבאמצעותם ניתן לספור את הזנים המושבלים שהופשטו משורשי הצמח, ולחשב את מספר החיידקים המיושבים הכולל על השורש 4,5.
ראשית, A. thaliana תורבית בתנאים הידרופוניים, ולאחר מכן תאי חיידקים חוסנו בריזוספרה בריכוז סופי של 0.01 OD600. רקמות השורש הנגועות נקצרו יומיים לאחר החיסון ונשטפו במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. יתר על כן, תאי חיידקים שהתיישבו על השורש נאספו, נמהלו במאגר מלח חוצץ פוספט (PBS), וצופו על מדיום אגר לוריא-ברטאני (LB). לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, נספרו ונורמלו מושבות בודדות על לוחות LB כדי לקבוע את תאי החיידקים המאוכלסים על השורשים.
שיטה זו ישימה מאוד, בעלת יכולת חזרה טובה, והיא מתאימה יותר לקביעת התיישבות חיידקית מדויקת בריזוספרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג יכולת שחזור טובה, ישנם ארבעה שלבים קריטיים לתהליך זיהוי הקולוניזציה של פרוטוקול זה. ראשית, יש לוודא שמספר תאי החיידקים המחוסנים זהה לחלוטין בכל ניסוי. שנית, יש צורך גם בשליטה על עוצמת ניקוי החיידקים הבלתי מיושבים באמצעות מים סטריליים. שלישית, כל תהליך דילול דגימה צריך להיות מערבו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32370135), תוכנית החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות (CAAS-CSAL-202302), פרויקט המדע והטכנולוגיה של המכללה המקצועית ג’יאנגסו לחקלאות וייעור (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
