Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-basierter Nachweis und Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA

Summary

Der auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Nachweis und die Quantifizierung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist eine empfindliche und genaue Methode zur Diagnose und Überwachung von HBV-Infektionen. Hier stellen wir ein Protokoll für den HBV-DNA-Nachweis und die Viruslastmessung einer Probe vor.

Abstract

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist weltweit eine der Hauptursachen für Lebererkrankungen. Es kann zu akuten oder chronischen Infektionen führen, was die Menschen sehr anfällig für tödliche Leberzirrhose und Leberkrebs macht. Der genaue Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA im Blut sind für die Diagnose und Überwachung einer HBV-Infektion unerlässlich. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von HBV-DNA ist die Echtzeit-PCR, mit der das Virus nachgewiesen und die Viruslast beurteilt werden kann, um das Ansprechen auf eine antivirale Therapie zu überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Das Kit verwendet Primer und Sonden, die auf die hochkonservierte Kernregion des HBV-Genoms abzielen und alle HBV-Genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I und J) genau quantifizieren können. Das Kit enthält auch eine endogene interne Kontrolle zur Überwachung einer möglichen PCR-Hemmung. Dieser Assay läuft über 40 Zyklen und sein Cutoff liegt bei 38 Ct. Für die Quantifizierung von HBV-DNA in klinischen Proben wird ein Satz von 5 Quantifizierungsstandards mit dem Kit geliefert. Die Standards enthalten bekannte Konzentrationen von HBV-spezifischer DNA, die gegen den 4^. Internationalen Standard der WHO für HBV-DNA für den Nukleinsäuretest (NIBSC-Code 10/266) kalibriert sind. Die Standards werden verwendet, um die Funktionalität der HBV-spezifischen DNA-Amplifikation zu validieren und eine Standardkurve zu erstellen, die die Quantifizierung von HBV-DNA in einer Probe ermöglicht. HBV-DNA mit einem Gehalt von nur 2,5 IE/ml wurde mit dem PCR-Kit nachgewiesen. Die hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Kits machen es zu einem leistungsstarken Werkzeug in klinischen Labors, das medizinisches Fachpersonal bei der effektiven Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen unterstützt.

Introduction

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein teilweise doppelsträngiges DNA-Virus aus der Gattung Orthohepadnavirus und der Familie der Hepadnaviridae ¹. Es kann eine chronische Infektion auslösen, die ein Leben lang anhält und möglicherweise zu Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom führt ^2,3,4. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) lebten im Jahr 2019 schätzungsweise 296 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-B-Infektion, und^{jedes Jahr} infizierten sich 1,5 Millionen Menschen neu 5.

Die Identifizierung und Messung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben dient als wertvolle Methode zum Nachweis von Personen mit einer laufenden Hepatitis-B-Infektion, zur Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Behandlung und zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolgs 6,7,8,9,10,11. Eine hohe Viruslast ist mit einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten von Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Leberkrebs, verbunden^12,13. Daher ist eine präzise Messung der Viruslast von entscheidender Bedeutung, um das Fortschreiten der HBV-Infektion zu verfolgen und Entscheidungen über die Behandlung zu treffen.

Quantitative Real-Time-PCR-Assays haben eine höhere Sensitivität, einen breiteren Dynamikbereich und eine genauere Quantifizierung der HBV-DNA als herkömmliche PCR-Techniken 14,15,16,17. Auf dem Markt sind mehrere kommerzielle real-time PCR-basierte molekulardiagnostische Kits für die Quantifizierung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben erhältlich. Hier beschreiben wir einen detaillierten Arbeitsablauf für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen, IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Bei dem Kit handelt es sich um einen weit verbreiteten, kostengünstigen und dennoch hochempfindlichen ^18,19-Test, dessen Leistungsmerkmale mit denen anderer kommerziell erhältlicher CE-gekennzeichneter Kits vergleichbar ^sind18. Neben der Amplifikation der HBV-Zielregion ist auch ein endogenes internes Kontrollgen im Kit enthalten, um die Qualität der Proben, die Qualität der extrahierten DNA, die PCR-Amplifikation und eine mögliche PCR-Hemmung zu überprüfen.

Protocol

An dieser Studie wurden keine menschlichen Teilnehmer oder klinischen Proben beteiligt. Das einzige biologische Material, das verwendet wurde, war der 4. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäuretests (NIBSC-Code 10/266). Bei dieser Norm handelt es sich um ein öffentlich zugängliches Referenzmaterial, das keine personenbezogenen oder identifizierbaren Daten enthält. Daher war für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich. 1. DNA-Extraktion<…

Representative Results

Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs zum Nachweis und zur Quantifizierung von HBV-DNA aus menschlichem Plasma/Serum ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Verstärkungsdiagramm von Standard 2 (als PC verwendet) und NTC für HBV und IC ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Amplifikationskurven für eine HBV-positive, eine HBV-negative Probe und eine Probe mit PCR-Inhibition. Die Amplifikationskurve, der Ct-Wert …

Discussion

Dem NIBSC-Code 10/266 wurde eine Einheit von 9.55.000 IE/ml zugewiesen, wenn er in 0,5 ml nukleasefreiem Wasser gemäß den Lieferanteninformationen²¹ rekonstituiert wird. Dies kann als hochbelastete HBV-positive Probe betrachtet werden. Die HBV-Viruslast, die mit dem in dieser Studie verwendeten Viruslast-Kit bestimmt wurde, betrug 6.65.900 IE/ml (Abbildung 4). Da die DNA-Extraktionseffizienz eines DNA-Extraktionskits nicht 100 % beträgt, geht während des Reinigung…

Materials

4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198