Summary
En simpel procedure til opdræt af axenisk Delia antiqua med halvfermenterede sterile kostvaner er beskrevet. Kun én Wolbachia-stamme blev påvist i hver stjerne af axenisk D. antiqua ved anvendelse af PCR.
Abstract
Axeniske insekter opnås fra sterile kunstige opdrætssystemer ved hjælp af sterile medier. Disse insekter, der er kendetegnet ved deres lille størrelse, korte vækstcyklus og lave foderbehov, er ideelle til at studere forholdet mellem mikroorganismer og værter. Tarmmikrobiota påvirker signifikant de fysiologiske egenskaber hos insektværter, og introduktion af specifikke stammer i axeniske insekter giver en metode til verifikation af tarmmikrobielle funktioner. Delia antiqua, et truende skadedyr i rækkefølgen Diptera, familie Anthomyiidae og slægten Delia, lever primært af løg, hvidløg, porrer og andre grøntsager af familien Liliaceae. Dens larver lever af pærerne og forårsager råtning, visning og endda død af hele planter. Ved opdræt af axenlarver kan opfølgningsundersøgelser udføres for at observere virkningerne af intestinal mikroflora på vækst og udvikling af D. antiqua. I modsætning til metoden, der involverer antibiotikaeliminering af associerede mikrober, præsenterer denne artikel en billig og højeffektiv tilgang til at hæve axenisk D. antiqua. Efter overfladesterilisering af D. antiqua-æg blev halvfermenterede sterile diæter brugt til at opdrætte larver, og den axeniske tilstand af D. antiqua blev verificeret gennem kulturafhængige og kulturuafhængige assays. Afslutningsvis har kombinationen af insektægsterilisering og fremstilling af sterile diæter til larvekultur muliggjort udviklingen af en effektiv og enkel metode til opnåelse af axensyre D. antiqua. Denne metode giver en stærk tilgang til at studere insekt-mikroflora interaktioner.
Introduction
Axeniske dyr, defineret som dyr, hvor der ikke kan påvises levedygtige mikroorganismer eller parasitter, er værdifulde eksperimentelle modeller til undersøgelse af interaktioner mellem værtsmikroorganisme 1,2. Insekter, den største gruppe af hvirvelløse dyr, kan danne symbiotiske forhold til mikroorganismer3. Axeniske insekter kan bruges til at studere værtssymbiontinteraktioner i symbiotiske systemer4. For eksempel etablerede Nishide et al.5 en praktisk steril opdrætsprocedure for malodorormen Plautia stali, hvilket muliggør pålidelig og streng analyse af vært-symbiont-interaktioner i modelsymbiotiske systemer. Axeniske insekter kan produceres ved sterilisering af ægstadiet og levering af steril mad til larverne og voksne 6,7. Axeniske insekter er af stor betydning og anvendes i vid udstrækning i biologisk forskning. For eksempel viste en undersøgelse foretaget af Somerville et al.8, at diamondback-møl podet med Enterobacter cloacae forbedrede tilpasningsevnen hos transgene mænd.
Delia antiqua Meigen er et økonomisk vigtigt skadedyr af løg og andre Liliaceae-afgrøder over hele verden, hvor dets larver beskadiger løgene i løg og andre Liliaceae-afgrøder9. D. antiqua findes hovedsageligt i tempererede klimaer og er udbredt i løgdyrkningsområder i Amerika, Europa og Asien. Hvis det ikke kontrolleres korrekt, kan det forårsage afgrødetab i løg (Allium cepa L.), hvidløg (Allium sativum L.), skalotteløg (Allium fistulosum L.) og porrer (Alliumchoenoprasum L.) fra 50% til 100%10,11. Larverne lever af de underjordiske plantedele, og denne fodring får frøplanterne til at visne og til sidst dø. Derudover kan beskadigede planter tillade patogener at komme ind, hvilket fører til pærerotting12. Selvom planterne ikke forbruges fuldstændigt af larverne, gør den skade, de forårsager, løgplanterne usælgelige og resulterer i økonomiske tab.
Insekter er tæt forbundet med tarmmikrobiota, og de fleste insekttarme indeholder en række symbiotiske bakterier, der trives med næringsstofferne fra værten13,14. Jing et al.15 viste, at den primære funktion af det intestinale symbiotiske samfund er at tilvejebringe essentielle næringsstoffer efterfulgt af funktioner relateret til fordøjelse og afgiftning. I visse tilfælde kan tarmbakterier tjene som en mikrobiel ressource til skadedyrsbekæmpelsesformål. Derfor er det ønskeligt at studere de enkelte tarmbakteriers præstationer og specifikke funktioner i kroppen af D. antiqua. Derfor er forberedelse af axeniske larver særlig vigtig for at studere interaktionerne mellem specifikke bakteriestammer og insekter16. I øjeblikket er en almindeligt anvendt metode til eliminering af insekttarmbakterier brugen af en antibiotikakombination til at udrydde associerede mikrober 17,18,19. I modsætning til at bruge antibiotika alene, som kun kan reducere mikrobielt antal, giver axenisk opdræt af insekter mulighed for kontrol over sammensætningen og mængden af mikroorganismer, hvilket muliggør en mere nøjagtig validering af tarmmikrobiotafunktionaliteten.
Således introducerer denne artikel en protokol til forberedelse og opdræt af axenisk D. antiqua. Axenisk larveføde opnås ved at anvende sterilisering ved høj temperatur af naturlige kostvaner kombineret med halvfermenterede fødevarer. Æggene steriliseres efter en eksperimentel protokol for at opnå axeniske æg, og endelig dyrkes axeniske larver fra de axeniske æg. Det axeniske opdrætssystem blev kun udført i en generation til forsøget. Dette vil give bekvemmelighed til at studere samspillet mellem insekter og tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua opnås fra feltet Fanzhen, Taian.
1. Tilberedning af sterile diæter
- Skræl de ydre lag af forårsløgene og kassér de grønne blade. Hold den hvide del af forårsløgene (figur 1A) og vask dem med sterilt vand, gentag skylleprocessen tre gange. Den hvide del af forårsløgene skæres i stykker i 1-2 cm terninger med en saks (se materialetabel) steriliseret med 75 % EtOH-opløsning (nævnt i trin 2.5) til senere brug.
- 50 g af forårsløgene i tern vejes og lægges i en foodprocessor (se materialetabellen). Tilsæt 50 ml steriliseret vand og mal dem fem gange i 2 minutter hver. Alle forårsløg i tern skal jordes til en pastalignende konsistens (figur 2A).
- Brug pincet til at overføre 10 stykker 3. stjernelarver af D. antiqua til et 10 ml centrifugerør indeholdende 10 ml 1x PBS, og mal dem med en engangsslibestøder (se materialetabel) i ca. 5 minutter for at opnå en larveslibevæske.
- Hæld den pastaagtige forårsløgsvæske og larveslibevæske i en ren 500 ml konisk kolbe (se materialetabel). Den koniske kolbemunding pakkes ind med to lag gennemsigtig forseglingsfilm, hvorefter kolben anbringes i en rystekuvøse (se materialetabellen) til gæring ved 25 °C og 180 o/min i 12 timer (figur 2B).
- Skær syv lag firkantet gasbind med 10 cm sider (intet behov for sterilitet) ud med en saks og stak dem sammen for at danne en simpel filteranordning. Hæld langsomt den fermenterede forårsløgsvæske på gasbindet og pres den filtrerede væske ud i en ny 500 ml konisk kolbe. Pak den resterende forårsløgsrest på gasbindet i stanniol til senere brug.
- Filtratet opnået i det foregående trin filtreres ved hjælp af en vakuumpumpe (se materialetabellen) og en Buchner-tragt. Sæt filterpapiret fugtet af deioniseret vand på Buchner-tragten, og hæld derefter filtratet og udfør sugefiltrering tre gange med forskelligt filterpapir. Det endelige filtrat opsamles i den 500 ml koniske kolbe.
- Udfør endnu en filtrering ved hjælp af en 0,22 μM filterflaske og en vakuumpumpe. Skru dækslet på sugefilterkolben i en ultraren bænk (se materialetabellen) til videre brug. På dette tidspunkt opnås den fermenterede forårsløgrest og filtrat (figur 2C).
BEMÆRK: Den filtrerede væske opnået fra dette trin vil være steril. (0,22 μM filterflaske er et sterilt vakuumfiltreringssystem til sterilisering af filtratet). - Gentag de foregående trin for at opnå ugæret forårsløgsrest og filtrat. Her er forskellen, at gæringen ikke er nødvendig.
- Af 0,24 g cholinchlorid og 0,56 g L-ascorbinsyre (se materialetabel) i et 10 ml centrifugeglas. Tilsæt 3 ml deioniseret vand og ryst kraftigt, indtil de er helt opløst. I den ultrarene bænk skal du bruge en ny 5 ml sprøjte og fastgøre tre 0,22 μM sprøjtefiltre (se materialetabellen) for at sterilisere opløsningen og placere den i et sterilt 10 ml centrifugerør til senere brug.
BEMÆRK: Cholinchlorid er en vigtig neurotransmitter for vækst af insekter, mens L-ascorbinsyre virker som konserveringsmiddel. - Der afvejes 2 g agarpulver og 6 g TSB (se materialetabel) og hældes i en 500 ml konisk kolbe. Derefter tilsættes 100 ml deioniseret vand for at forberede dyrkningsmediet. Efter skylning af glasstangen med deioniseret vand skal du bruge den til at røre blandingen, indtil den er godt blandet. Derefter forsegles den koniske kolbe ved hjælp af to lag gennemsigtig tætningsfilm.
- De gærede forårsløg og ufermenterede forårsløg (nævnt i trin 1.5 og trin 1.8) pakkes ind i aluminiumsfolie og steriliseres sammen med dyrkningsmediet i en autoklave ved 121 °C i 20 min.
- I den ultrarene bænk hældes det steriliserede cholinchlorid, L-ascorbinsyre og sterilt filtrat i dyrkningsmediet, mens du forsigtigt hvirvler for at blande dem grundigt. Til sidst tilsættes de gærede og ufermenterede forårsløg og rystes kraftigt i hånden for at opnå de sterile kostvaner. Hæld diæterne i 50 ml centrifugerørene (steril; udluftningshætte med en 0,22 μM PVDF hydrofob membran) (se materialetabel) i en vinkel (figur 2D).
BEMÆRK: Efter sterilisering skal dyrkningsmediets temperatur holdes mellem 65-80 °C for at forhindre hurtig afkøling og størkning ved tilsætning af forårsløg eller andre ingredienser. Desuden hældes ca. 10-15 ml diæter i hvert rør. Når kosten er størknet, opbevares rørene i køleskab ved 4 °C, hvis det ikke anvendes straks.
2. Erhvervelse af axeniske æg
- Laboratorieopdræt af D. antiqua
- Anbring et opdrætsbur i en 25 °C indvendigt LED-belyst inkubator (24 timer i døgnet, forholdet mellem lys og mørke er 16:8) til voksne hanner og hunner, så de kan parre sig og lægge æg. Fyld vanddispenseren (figur 1B) med vand og forsegl den med fugtet vat for at give vand til de voksne.
- Læg fire 35 mm x 12 mm petriskålbunde i et 94 mm x 16 mm petriskållåg. Våd vat med ioniseret vand og læg derefter fugtig vat ved to af petriskålens bunde, og oven på vattet tilsættes en spiseskefuld saccharose.
- Fyld de to andre petriskålbunde med to spiseskefulde saccharose og gærekstrakt (se materialetabel), der tjener som mad til de voksne insekter (figur 1C).
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at sterilisere saccharose og gærekstrakt nævnt i trin 2.1.2 og 2.1.3. - Sæt en 94 mm x 16 mm petriskål bund indeholdende fugtet sand og et stykke rodløst, skrællet hvidløgsfed (figur 1D) inde i flueburet for at samle æg. Kvinden vil blive tiltrukket af duften af hvidløg og lægge æg omkring den.
- Indsamling af æg
- Tag ovipositionsanordningen, som er en 94 mm x 16 mm petriskål indeholdende sand og hvidløg nævnt ovenfor (trin 2.14), ud af buret. Hæld sandet sammen med hvidløg i et 500 ml bægerglas, og brug postevand til at skylle de resterende æg fra hvidløg ind i bægerglasset. På dette tidspunkt flyder æggene i vandet.
- Tag en sigte med 100 masker (se materialetabellen), og fugt den med ledningsvand. Hæld derefter vandet med de flydende æg fra bægerglasset på sigten. Æggene forbliver på sigten.
- Når æggene naturligt tørrer på sigten, skal du bruge en børste til forsigtigt at feje æggene på en petriskål.
- På den første dag skylles ovipositionsanordningen for at samle æggene uden desinfektion eller sterilisering. På den anden dag klokken fire om eftermiddagen skylles æggene igen og samles ved at sigte dem med rent vand.
BEMÆRK: Indsamling af æggene på den anden dag er for at sikre ensartet vækstrate i de efterfølgende faser. Klokken fire om eftermiddagen er æglægningstoppestedet for D. antiqua. Det er således ideelt at samle æggene på dette tidspunkt. - Anbring de indsamlede æg på en steril cellesigte (se materialetabel) i den ultrarene bænk (figur 3A).
- Forbered opløsningen til ægsterilisering
- Tag 5 ml 5,2% NaClO (se materialetabel) og overfør det til en steriliseret 250 ml konisk kolbe. Tilsæt 95 ml steriliseret vand for at opnå et samlet volumen på 100 ml, hvilket resulterer i en 0,26 % NaClO-opløsning.
- For at fremstille en 75% EtOH opløsning tages 75 ml 99,7% EtOH og overføres til en steriliseret 250 ml konisk kolbe. Tilsæt 25 ml steriliseret vand for at opnå et samlet volumen på 100 ml, hvilket resulterer i en 75% EtOH-opløsning.
- Hæld 30 ml NaClO i et petrifad og hæld 30 ml EtOH i en anden petriskål. Cellesigten med æg, der er nævnt i trin 2.4, anbringes i skålen med NaClO. Læg det i blød i 0,26% NaClO-opløsningen i 0,5 min. Overfør derefter sigten til fadet med EtOH, så den kan trække i 75% EtOH-opløsningen i yderligere 0,5 minutter.
- Gentag denne proces tre gange, skiftevis mellem 0,26% NaClO og 75% EtOH hvert 0,5 minut. Derefter opnås axeniske æg. På dette tidspunkt skal sigten, der indeholder æggene, nedsænkes i EtOH.
BEMÆRK: For at sikre grundig sterilisering skal du bruge en 1 ml pipette til at aspirere NaClO og EtOH og sprede æggene. Gentag skylleprocessen flere gange. Dette trin vil yderligere rense overfladen af æggene fra resterende bakterier og urenheder, hvilket sikrer en ren og steril overflade.
3. Opdræt af axeniske larver
- For at overføre de steriliserede æg skal du bruge en saks, der er steriliseret med en alkohollampe, til at skære endespidsen af en 1 ml pipette (figur 3B). Sørg for, at endeåbningen af den afskårne pipette er større end æggens diameter (ca. 2 mm). Brug derefter pipetten til at overføre æggene fra EtOH-opløsningen (æg sammen med opløsningen) (figur 3C) til et centrifugerør, der indeholder den sterile diæt, og hvert rør skal indeholde ca. 20-50 æg (figur 3D). Gentag denne proces, indtil alle æggene er overført.
BEMÆRK: Pipettespidsens diameter skal være så stor som muligt for at undgå, at æggene knækker under oplægningen, hvilket kan føre til deres død. - Brug en pipette til at fjerne overskydende ethanol fra røret. Placer centrifugerøret lukket med låg inde i en selvforseglende pose, og læg et stykke bomuld ved åbningen af posen for at tillade luftcirkulation. Til sidst anbringes posen i en 25 °C inkubator (relativ luftfugtighed: 50%-70%; fotoperiode: 16 timer lys: 8 timer mørk) til observation og dyrkning.
- Ca. tre dage senere begynder de axeniske æg i kosten at klække (figur 4A). De klækkede larver vil være aktive, og overfladen af de sterile diæter vil ikke længere være glat. Larverne begynder at fodre på kostvanerne.
- Fortsæt med at observere larverne, indtil de når scenen af 2. instar larver. Hold øje med deres vækst og udvikling i denne periode.
- Efter 9-12 dage har mere end 80% af æggene udviklet sig til 3. stjernelarver (figur 4B). Dette indikerer vellykket vækst og udvikling af larverne.
4. Validering af axeniske larver med dyrkningsafhængige assays
- Vælg tilfældigt tre axeniske 3. stjernelarver fra centrifugerøret.
- Læg larverne i en 94 mm x 16 mm petriskål indeholdende 75% alkohol til rengøring. Derefter overføres dem til en beholder med sterilt vand til yderligere skylning.
- Brug en desinficeret dissekerende tang, der er steriliseret med 75% EtOH-opløsning til at gribe fat i larverne (hoved og hale er vist i figur 5A). Brug dissekersaks til at fjerne hoved- og haleender (figur 5B). Hold larvernes hale med tangen og brug en anden tang til forsigtigt at klemme fra halen til hovedet og ekstrahere de indre organer (resultatet vist i figur 5C). Placer de indre organer i deioniseret vand og træk forsigtigt tarmen ud ved at trykke på fedtvævet med tang, og læg det ekstraherede indre (figur 5D) i sterilt vand til videre brug.
- Placer tarmen i et sterilt 1,5 ml centrifugerør, tilsæt 500 μL steriliseret 1x PBS-buffer, og brug en engangsstøder til at male tarmvævet til et homogenat.
- Der udtages 100 μL homogenat, og der tilsættes det til et næringsagarmedium. Brug en L-formet spreder (se Materialetabel) til at stribe agarpladen.
- Petriskålen anbringes i en biokemisk inkubator ved 28 °C og inkuberes i 72 timer for at observere koloniernes vækst.
5. Validering af axeniske larver med dyrkningsuafhængige assays
- Uddrag total DNA fra tarmvævet hos axeniske larver ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel) efter producentens anvisninger.
- Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et UV-spektrofotometer.
- Udfør PCR-reaktion ved hjælp af universelle bakterielle 16S rRNA-primere (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Det samlede reaktionsvolumen er 25 μL, og det består af 1 μL DNA-skabelon, 0,5 μL fremadgående primer, 0,5 μL omvendt primer, 10,5 μL ddH2O og 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (se materialetabel). PCR-reaktionsbetingelserne indstilles som følger: indledende denaturering ved 94 °C i 3 minutter; 35 denatureringscyklusser ved 94 °C i 30 s, udglødning ved 55 °C i 30 s og forlængelse ved 72 °C i 90 s endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min. PCR-produkterne opbevares ved 4 °C til yderligere analyse.
- Udfør PCR-reaktion ved hjælp af universelle svampe ITS-primere (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Det samlede reaktionsvolumen er 25 μL, og det består af 1 μL DNA-skabelon, 0,5 μL fremadgående primer, 0,5 μL omvendt primer, 10,5 μL ddH2O og 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Indstil PCR-betingelserne til 95 °C i 5 minutter; 35 cyklusser på 95 °C i 30 s, 55 °C i 1 min og 72 °C i 90 s efterfulgt af 72 °C i 10 min. PCR-produkterne opbevares ved 4 °C til yderligere analyse.
- Brug Super Green nukleinsyrefarvestof (se materialetabel) til at blande jævnt med hver af de to typer PCR-produkter og analysere dem ved elektroforese på en 1% agarosegel i 1x TAE-buffer (fortyndet fra 50x TAE, se materialetabel). Brug 3 μL DNA-markør (se materialetabel) som reference.
- Brug en UV-transilluminator til at observere gelen og lokalisere målfragmentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Livsstadierne af D. antiqua er afbildet i figur 4. Den komplette livscyklus omfatter æg, larver, puppe (figur 4C) og voksne (figur 4D). De dyrkes i sterile centrifugerør, og deres udseende og overlevelsesrate kan ikke skelnes fra D. antiqua opdrættet under ikke-axeniske forhold. Vækst- og udviklingstiderne for hvert trin i D. antiqua kan findes i figur 6. Ægstadiet hos ikke-aksenopdrættede D. antiqua er 2,83 ± 0,29 dage, og ægstadiet hos aksenopdrættede D. antiqua er 2,83 ± 0,29 dage uden signifikant forskel mellem de to (uafhængig t-test, t = 0,00, p = 1,00). Det normale larvestadie varer i 13,83 ± 0,76 dage, mens det axeniske larvestadie varer i 14,50 ± 0,50 dage uden signifikant forskel mellem de to (Uafhængig t-test, t = 1,27, p = 0,27). Puppestadiet hos normalt opdrættede D. antiqua er 17,33 ± 0,76 dage, og hos aksenopdrættede D. antiqua er 18,00 ± 0,50 dage uden signifikant forskel mellem de to (uafhængig t-test, t = 1,27, p = 0,27). Overlevelsestiden for voksne er 81,50 ± 1,00 dage for normal opdræt og 80,33 ± 0,76 dage for axenisk opdræt uden signifikant forskel mellem de to (uafhængig t-test, t = 1,61, p = 0,18). Det kan observeres, at der ikke er nogen signifikant forskel i udviklingstiden mellem axenisk D. antiqua og dem, der hæves under normale forhold.
Kulturafhængige analyser viste, at der ikke blev påvist kolonier i larvesttarmene (figur 7). Desuden afslørede PCR-analyse baseret på bakterielt 16S rRNA tilstedeværelsen af et bånd på omkring 1500 bp (figur 8A), identificeret som Wolbachia (GenBank-tiltrædelsesnummeret for denne nukleotidsekvens er: OR564190), en endosymbiotisk bakterie. Der blev imidlertid ikke observeret bånd i PCR-analysen rettet mod svampe-ITS-regioner (figur 8B). Dette indikerer, at larverne har opnået axenisk tilstand. Axeniske larver er af stor betydning for at studere mekanismerne for interaktion mellem D. antiqua og mikroorganismer samt for at forebygge og kontrollere skader forårsaget af D. antiqua.
Figur 1: Opdræt og foder til D. antiqua. (A) Den hvide del af forårsløg til larver. (B) Vanddispenser til voksne. C) Fødevarer til voksne. D) Udtagningsanordning til æggene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bestanddele af tilberedning af kost. (A) Forårsløg. (B) Gærede forårsløg. C) Fermenteret forårsløgsrest og filtrat. d) Tilberedte kostvaner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Processen med ægoverførsel. A) Æg i cellesigten. (B) 1 ml pipette uden endespids. C) 1 ml pipette med æg. D) Æg, der overføres til kost. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Livsstadier af axenisk D. antiqua. (A) Æg. b) larver. c) Puppe. (D) Voksne kvinder og mænd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Processen med at dissekere larvetarmene. (A) Larvens hoved og hale. (B) Larven med hoved og hale fjernet. (C) Separeret tarm- og kropsvæv. (D) En intakt tarm efter dissektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Udviklingstid for hvert vækststadium for normalt opdrættede og aksenopdrættede D. antiqua. Ingen signifikant forskel i udviklingstid mellem aksenopdrættede og normalt opdrættede D. antiqua. Uafhængig t-test, p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Bekræftelse af steriliteten af D. antiqua ved tilfældig udvælgelse af tre larver og inkubation af tarmhomogenater på TSA- og PDA-agarplader. Der blev ikke observeret bakterier i larver fodret med sterile kostvaner. (A) Axeniske larver på TSA. (B) Normale larver på TSA. (C) Axeniske larver på PDA. (D) Normale larver på PDA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Bekræftelse af steriliteten af D. antiqua ved PCR-analyse ved anvendelse af universelle 16S rRNA-primere og svampe-ITS-primere. Målbåndet for 16S rRNA-genet er ~ 1.500 bp. Et bånd på ca. 1500 bp blev observeret og identificeret som den endosymbiotiske bakterie Wolbachia. ITS-genets målbånd er 500-750 bp. Der blev ikke observeret noget målbånd i AF-grupperne. (A) 16S rRNA elektropherogram. B) ITS-elektroferogrammet. Forkortelser: M = markør; NC = negativ kontrol NF = normal fodring AF = axenisk fodring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insekter besidder en meget kompleks tarmmikrobiota20,21, hvilket nødvendiggør brug af axeniske insekter podet med specifikke tarmmikrobielle stammer til undersøgelse af insekt-mikroorganismeinteraktioner. Forberedelsen af axeniske insekter er afgørende for sådanne forskningsbestræbelser. Antibiotikabehandling er en metode, der anvendes til at eliminere tarmmikrobiota. For eksempel fodrede Jung og Kim22 Spodoptera exigua med penicillin, mens Raymond23 fodrede P. xylostella med en kunstig diæt indeholdende rifampicin for at rydde tarmbakterierne. Antibiotikabehandling kan dog ikke helt eliminere tarmbakterier og har mange bivirkninger på værtsinsekter. Disse omfatter ændringer i metabolisk enzymaktivitet, nedsat tarmfunktion, hæmning af vækst, udvikling og reproduktion samt øget dødelighed 23,24,25. Derfor kan funktionaliteten af insekttarmens mikrobiota maskeres efter antibiotikabehandling. Heldigvis kan dette problem løses ved kemisk desinfektion af ægens overflade, hvilket giver mulighed for produktion af axeniske insekter med relativ lethed16. Til sammenligning er kombinationen af overfladedesinfektion af æggene efterfulgt af fodring med sterile diæter mere effektiv og gennemførlig end antibiotikabehandling26,27.
Opnåelse af axensyre D. antiqua er primært afhængig af at udnytte axeniske æg og sterile kostvaner. Sammenlignet med andre insektarter er æggene af D. antiqua relativt små. Tidligere anvendte desinfektionsmetoder, såsom kortvarig blødning af æggene i 0,1% natriumdodecylbenzensulfonat efterfulgt af en 5 minutters behandling med en 2% hydrogenperoxidopløsning for at opnå axeniske kakerlakæg28 eller anvendelse af en 10% natriumhypochloritopløsning i 10 minutter til overfladedesinfektion af æg af den røde palmevæv29, er ikke egnede til desinfektion af D. antiqua æg. Tidligere undersøgelser af desinfektion af æg af Diptera-arter, såsom anvendelse af hydrogenperoxidopløsninger, der anvendes som hånddesinfektionsmiddel og hydrogenperoxid som overfladedesinfektionsmiddel til sterilisering af Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) æg30, findes. Derfor bliver det nødvendigt at optimere valget af desinfektionsmiddel og desinfektionstid. Efter forsøg har det vist sig, at ved anvendelse af 0,26% NaClO og 75% EtOH, desinfektion af æggene i 0,5 minutter og gentagelse af processen tre gange kan opnå sterilisering af D. antiqua æg.
Efter at have opnået axeniske æg er et andet afgørende aspekt ved opdræt af axensyre D. antiqua at give dem sterile diæter til larverne in vitro. Selvom kunstig kost ikke fuldt ud kan replikere naturlig mad, har undersøgelser 31,32,33 vist muligheden for at opdrætte insekter ved hjælp af kunstige kostvaner. Næringsindholdet i kunstige kostvaner kan påvirke insekters immunsystem og tilpasningsevne34. Derfor er det vigtigt for kunstigt fremstillede kostvaner at indeholde lignende ernæringsmæssige komponenter til naturlig mad. Dette vil hjælpe med at sikre, at de opdrættede insekter får de nødvendige næringsstoffer til deres udvikling, immunrespons og generelle sundhed. I denne undersøgelse tjener forårsløg som den primære komponent i sterile kostvaner til D. antiqua. Halvfermenterede kostvaner giver bedre næringsstoffer til D. antiqua, hvilket bidrager til deres vækst og udvikling. Derudover har blanding af larvehomogenatet med kosten til formål at lette fordøjelsen af kosten af tarmmikrobiota uden for kroppen. Dette skyldes, at tarmbakterier har en effekt på insektfodring og fordøjelse35. Brug af denne metode til fremstilling af sterile kostvaner til D. antiqua forenkler processen og forbedrer effektiviteten af diætforberedelsen betydeligt.
Bakterielle symbionter, der overføres maternelt i celler, er bredt til stede i insekter36. Wolbachia, en intracellulær bakterie, der overføres moderligt, er til stede i adskillige insekter37. Wolbachia er mest kendt for sin rolle i reproduktiv manipulation, da det kan skævvride kønsforholdet mellem værtsens afkom mod at producere flere inficerede kvinder38. Efter at have verificeret den axeniske tilstand af D. antiqua larver blev det konstateret, at larverne i det væsentlige var axeniske efter desinfektion, bortset fra de endosymbiotiske bakterier Wolbachia, der var til stede i cytoplasmaet af ovarievævsceller i D. antiqua og transmitteret lodret på tværs af generationer gennem cytoplasmaet af ægceller. Hvad angår metoden til eliminering af Wolbachia, er antibiotikabehandling en fælles tilgang. Sammenfattende præsenterer denne artikel en metode til opdræt af axenisk D. antiqua. Ifølge protokollen kan axenic D. antiqua med succes opdrættes. Desuden er denne metode kendetegnet ved sin enkelhed og lave omkostninger, hvilket giver en ny tilgang til opdræt af andre axeniske insekter og øger muligheden for at studere interaktionerne mellem insekter og tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32272530), New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2021TZXD002) og Science and Education Integration Project of Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
