Summary
Er wordt een eenvoudige procedure beschreven voor het kweken van axenische Delia antiqua met halfgefermenteerde steriele diëten. Met behulp van PCR werd slechts één Wolbachia-stam gedetecteerd in elke instar van axenische D. antiqua .
Abstract
Axenische insecten worden verkregen uit steriele kunstmatige kweeksystemen met behulp van steriele media. Deze insecten, gekenmerkt door hun kleine formaat, korte groeicyclus en lage voedingsbehoefte, zijn ideaal voor het bestuderen van de relatie tussen micro-organismen en gastheren. De darmmicrobiota heeft een aanzienlijke invloed op de fysiologische kenmerken van insectengastheren, en het introduceren van specifieke stammen in axenische insecten biedt een methode om de microbiële functies van de darm te verifiëren. Delia antiqua, een bedreigende plaag in de orde Diptera, familie Anthomyiidae en geslacht Delia, voedt zich voornamelijk met uien, knoflook, prei en andere groenten van de familie Liliaceae. De larven voeden zich met de bollen en veroorzaken rotting, verwelking en zelfs de dood van hele planten. Door axenische larven te kweken, kunnen vervolgstudies worden uitgevoerd om de effecten van darmmicroflora op de groei en ontwikkeling van D. antiqua te observeren. In tegenstelling tot de methode waarbij antibiotica geassocieerde microben elimineren, presenteert dit artikel een goedkope en zeer efficiënte benadering voor het kweken van axenische D. antiqua. Na oppervlaktesterilisatie van D. antiqua-eieren , werden halfgefermenteerde steriele diëten gebruikt om larven groot te brengen, en de axenische toestand van D. antiqua werd geverifieerd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke tests. Kortom, de combinatie van sterilisatie van insecteneieren en de bereiding van steriele diëten voor larvale cultuur heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van een efficiënte en eenvoudige methode voor het verkrijgen van axenische D. antiqua. Deze methode biedt een krachtige benadering voor het bestuderen van interacties tussen insecten en microflora.
Introduction
Axenische dieren, gedefinieerd als dieren waarin geen levensvatbare micro-organismen of parasieten kunnen worden gedetecteerd, zijn waardevolle experimentele modellen voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en micro-organisme 1,2. Insecten, de grootste groep ongewervelde dieren, kunnen symbiotische relaties aangaan met micro-organismen. Axenische insecten kunnen worden gebruikt om gastheer-symbiontinteracties in symbiotische systemen te bestuderen4. Nishide et al.5 hebben bijvoorbeeld een praktische steriele kweekprocedure voor de onwelriekende worm Plautia stali vastgesteld, waardoor een betrouwbare en rigoureuze analyse van gastheer-symbionteninteracties in modelsymbiotische systemen mogelijk wordt. Axenische insecten kunnen worden geproduceerd door het eistadium te steriliseren en steriel voedsel te geven aan de larven en volwassenen 6,7. Axenische insecten zijn van groot belang en worden veel gebruikt in biologisch onderzoek. Een studie uitgevoerd door Somerville et al.8 toonde bijvoorbeeld aan dat diamantrugmotten die waren ingeënt met Enterobacter cloacae het aanpassingsvermogen van transgene mannetjes verbeterden.
Delia antiqua Meigen is een economisch belangrijke plaag voor uien en andere Liliaceae-gewassen wereldwijd, waarbij de larven de bollen van uien en andere Liliaceae-gewassen beschadigen9. D. antiqua komt voornamelijk voor in gematigde klimaten en is wijdverbreid in uienteeltgebieden van Noord- en Zuid-Amerika, Europa en Azië. Als het niet goed wordt bestreden, kan het leiden tot oogstverliezen bij uien (Allium cepa L.), knoflook (Allium sativum L.), sjalotten (Allium fistulosum L.) en prei (Alliumchoenoprasum L.), variërend van 50% tot 100%10,11. De larven voeden zich met de ondergrondse delen van planten, en deze voeding zorgt ervoor dat de zaailingen verwelken en uiteindelijk sterven. Bovendien kunnen beschadigde planten ziekteverwekkers binnenlaten, wat leidt tot bolrot12. Zelfs als de planten niet volledig door de larven worden geconsumeerd, maakt de schade die ze veroorzaken de uienplanten onverkoopbaar en resulteert dit in economische verliezen.
Insecten zijn nauw verbonden met de darmmicrobiota en de meeste insectendarmen bevatten een verscheidenheid aan symbiotische bacteriën die gedijen op de voedingsstoffen die door de gastheer worden geleverd 13,14. Jing et al.15 toonden aan dat de primaire functie van de intestinale symbiotische gemeenschap het leveren van essentiële voedingsstoffen is, gevolgd door functies die verband houden met spijsvertering en ontgifting. In bepaalde gevallen kunnen darmbacteriën dienen als microbiële hulpbron voor ongediertebestrijding. Daarom is het wenselijk om de prestaties en specifieke functies van de individuele darmbacteriën in het lichaam van D. antiqua te bestuderen. Daarom is het prepareren van axenische larven bijzonder belangrijk voor het bestuderen van de interacties tussen specifieke bacteriestammen en insecten16. Momenteel is een veelgebruikte methode om insectendarmbacteriën te elimineren het gebruik van een antibioticacombinatie om geassocieerde microben uit te roeien 17,18,19. In tegenstelling tot het gebruik van antibiotica alleen, die alleen het aantal microben kunnen verminderen, maakt axenische kweek van insecten controle mogelijk over de samenstelling en hoeveelheid micro-organismen, waardoor een nauwkeurigere validatie van de functionaliteit van de darmmicrobiota mogelijk wordt.
Daarom introduceert dit artikel een protocol voor het bereiden en kweken van axenische D. antiqua. Axenisch larvale voedsel wordt verkregen door gebruik te maken van sterilisatie op hoge temperatuur van natuurlijke diëten in combinatie met half gefermenteerd voedsel. De eieren worden gesteriliseerd volgens een experimenteel protocol om axenische eieren te verkrijgen, en ten slotte worden axenische larven gekweekt uit de axenische eieren. Het axenische kweeksysteem werd voor het experiment slechts voor één generatie uitgevoerd. Dit biedt gemak voor het bestuderen van de interactie tussen insecten en darmmicrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua worden verkregen uit het veld van Fanzhen, Taian.
1. Bereiding van steriele diëten
- Schil de buitenste lagen van de lente-uitjes en gooi de groene bladeren weg. Bewaar het witte deel van de lente-uitjes (figuur 1A) en was ze met steriel water, waarbij u het spoelproces drie keer herhaalt. Snijd het witte gedeelte van de lente-uitjes met een schaar (zie Materiaaltabel) in blokjes van 1-2 cm gesneden en steriliseerd met 75 % EtOH-oplossing (zie stap 2.5) voor later gebruik.
- Weeg 50 g van de in blokjes gesneden lente-uitjes af en doe ze in een keukenmachine (zie Materiaaltabel). Voeg 50 ml gesteriliseerd water toe en maal ze vijf keer gedurende 2 minuten. Alle in blokjes gesneden lente-uitjes moeten worden vermalen tot een pasta-achtige consistentie (Figuur 2A).
- Gebruik een pincet om 10 stuks 3rd instar-larven van D. antiqua over te brengen in een centrifugebuis van 10 ml met 10 ml 1x PBS, en maal ze met een wegwerpmalstamper (zie Materiaaltabel) gedurende ongeveer 5 minuten om een larvale maalvloeistof te verkrijgen.
- Giet de pasteuze lente-uitjesvloeistof en de larvale maalvloeistof in een schone erlenmeyer van 500 ml (zie Materiaaltabel). Wikkel de mond van de erlenmeyer in twee lagen doorzichtige afdichtingsfolie en plaats de kolf vervolgens in een schudincubator (zie materiaaltabel) voor gisting bij 25 °C en 180 omw/min gedurende 12 uur (figuur 2B).
- Knip zeven lagen vierkant gaas met zijden van 10 cm (geen steriliteit nodig) uit met een schaar en stapel ze op elkaar om een eenvoudig filterapparaat te vormen. Giet langzaam de gefermenteerde lente-uitjesvloeistof op het gaas en knijp de gefilterde vloeistof eruit in een nieuwe conische kolf van 500 ml. Wikkel de resterende lente-uitjesresten op het gaas in aluminiumfolie voor later gebruik.
- Filtreer het in de vorige stap verkregen filtraat met behulp van een vacuümpomp (zie Materiaaltabel) en een Buchner-trechter. Leg het filterpapier bevochtigd met gedeïoniseerd water op de Buchner-trechter en giet vervolgens het filtraat en voer drie keer zuigfiltratie uit met ander filterpapier. Vang het uiteindelijke filtraat op in de erlenmeyer van 500 ml.
- Voer nog een filtratie uit met een filterfles van 0,22 μM en een vacuümpomp. Schroef het deksel van de zuigfilterkolf in een ultraschone werkbank (zie Materiaaltabel) voor verder gebruik. Op dit punt worden het gefermenteerde lente-uitjesresidu en filtraat verkregen (figuur 2C).
NOTITIE: De gefilterde vloeistof die uit deze stap wordt verkregen, is steriel. (0,22 μM filterfles is een steriel vacuümfiltratiesysteem voor het steriliseren van het filtraat). - Herhaal de vorige stappen om ongefermenteerde lente-uitjesresten en filtraat te verkrijgen. Hier is het verschil dat de fermentatie niet nodig is.
- Weeg 0,24 g cholinechloride en 0,56 g L-ascorbinezuur (zie materiaaltabel) af in een centrifugebuisje van 10 ml. Voeg 3 ml gedeïoniseerd water toe en schud krachtig totdat ze volledig zijn opgelost. Gebruik in de ultraschone werkbank een nieuwe spuit van 5 ml en bevestig drie spuitfilters van 0,22 μM (zie Materiaaltabel) om de oplossing te steriliseren en plaats deze in een steriele centrifugebuis van 10 ml voor later gebruik.
OPMERKING: Cholinechloride is een essentiële neurotransmitter voor de groei van insecten, terwijl L-ascorbinezuur als conserveermiddel werkt. - Weeg 2 g agarpoeder en 6 g TSB af (zie materiaaltabel) en giet ze in een erlenmeyer van 500 ml. Voeg vervolgens 100 ml gedeïoniseerd water toe om het kweekmedium te bereiden. Nadat je de glazen staaf hebt gespoeld met gedeïoniseerd water, gebruik je deze om het mengsel te roeren tot het goed gemengd is. Sluit vervolgens de erlenmeyer af met twee lagen transparante afdichtingsfolie.
- Wikkel de gefermenteerde lente-uitjes en ongefermenteerde lente-uitjes (vermeld in stap 1.5 en stap 1.8) in aluminiumfolie en steriliseer ze, samen met het kweekmedium, in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 min.
- Giet in de ultraschone bank het gesteriliseerde cholinechloride, L-ascorbinezuur en steriel filtraat in het kweekmedium terwijl u voorzichtig ronddraait om ze grondig te mengen. Voeg ten slotte de gefermenteerde en ongefermenteerde lente-uitjes toe en schud krachtig met de hand om de steriele diëten te verkrijgen. Giet de diëten onder een hoek in de centrifugebuisjes van 50 ml (steriel; ontluchtingsdop met een 0,22 μM PVDF hydrofoob membraan) (zie Materiaaltabel) (Figuur 2D).
OPMERKING: Na sterilisatie moet de temperatuur van het kweekmedium tussen 65-80 °C worden gehouden om snelle afkoeling en stolling te voorkomen bij het toevoegen van lente-uitjes of andere ingrediënten. Giet bovendien in elke buis ongeveer 10-15 ml diëten. Zodra de diëten gestold zijn, bewaart u de tubes in de koelkast bij 4 °C, als deze niet onmiddellijk worden gebruikt.
2. Verwerving van axenische eieren
- Laboratoriumopfoksysteem voor D. antiqua
- Plaats een opfokkooi in een inwendig LED-verlichte broedmachine van 25 °C (24 uur per cyclus, de verhouding tussen licht en donker is 16:8) om mannelijke en vrouwelijke volwassen dieren groot te brengen, zodat ze kunnen paren en eieren kunnen leggen. Vul de waterdispenser (Figuur 1B) met water en sluit deze af met bevochtigde watten om de volwassenen van water te voorzien.
- Plaats vier petrischaalbodems van 35 mm x 12 mm in een deksel van een petrischaal van 94 mm x 16 mm. Maak watten nat met geïoniseerd water en leg vervolgens vochtige watten op twee van de bodems van de petrischaal, en voeg bovenop de watten een eetlepel sucrose toe.
- Vul de andere twee bodems van petrischalen met twee eetlepels sacharose en gistextract (zie Materiaaltabel), die dienen als voedsel voor de volwassen insecten (Figuur 1C).
OPMERKING: De in stap 2.1.2 en stap 2.1.3 genoemde sacharose en gistextract hoeven niet te worden gesteriliseerd. - Leg een petrischaalbodem van 94 mm x 16 mm met bevochtigd zand en een stuk ongeworteld, gepeld teentje knoflook (Figuur 1D) in de vliegenkooi om eieren te verzamelen. Het vrouwtje wordt aangetrokken door de geur van de knoflook en legt er eieren omheen.
- Inzameling van eieren
- Haal het ovipositieapparaat, een petrischaaltje van 94 mm x 16 mm met zand en knoflook als hierboven vermeld (stap 2.14), uit de kooi. Giet het zand samen met de knoflook in een bekerglas van 500 ml en spoel met kraanwater de resterende eieren van de knoflook in het bekerglas. Op dit punt drijven de eieren in het water.
- Neem een zeef met 100 mazen (zie Tabel met materialen) en bevochtig deze met kraanwater. Giet vervolgens het water met de drijvende eieren uit het bekerglas op de zeef. De eieren blijven op de zeef liggen.
- Nadat de eieren op natuurlijke wijze op de zeef zijn opgedroogd, gebruikt u een borstel om de eieren voorzichtig op een petrischaal te vegen.
- Spoel op de eerste dag het ovipositieapparaat door om de eieren te verzamelen zonder desinfectie of sterilisatie. Spoel op de tweede dag om vier uur 's middags de eieren opnieuw door en verzamel ze door ze te zeven met schoon water.
OPMERKING: Het verzamelen van de eieren op de tweede dag is om een consistente groeisnelheid in de volgende fasen te garanderen. Vier uur 's middags is de eilegpiek voor D. antiqua. Het is dus ideaal om op dit moment de eieren te verzamelen. - Plaats de verzamelde eieren op een steriele celzeef (zie Materiaaltabel) in de ultraschone bank (Figuur 3A).
- Bereid de oplossing voor op sterilisatie van eieren
- Neem 5 ml 5,2% NaClO (zie Materiaaltabel) en breng dit over in een gesteriliseerde erlenmeyer van 250 ml. Voeg 95 ml gesteriliseerd water toe om een totaal volume van 100 ml te maken, wat resulteert in een 0,26 % NaClO-oplossing.
- Om een 75% EtOH-oplossing te bereiden, neemt u 75 ml 99,7 % EtOH en brengt u dit over in een gesteriliseerde erlenmeyer van 250 ml. Voeg 25 ml gesteriliseerd water toe om een totaal volume van 100 ml te maken, wat resulteert in een 75% EtOH-oplossing.
- Giet 30 ml NaClO in een petrischaaltje en giet 30 ml EtOH in een ander petrischaaltje. Plaats de celzeef met de in stap 2.4 genoemde eieren in de schaal met NaClO. Week het 0,5 minuut in de 0,26% NaClO-oplossing. Breng vervolgens de zeef over naar de schaal met EtOH en laat deze nog 0,5 minuut weken in de 75% EtOH-oplossing.
- Herhaal dit proces drie keer, afwisselend tussen 0,26% NaClO en 75% EtOH om de 0,5 minuut. Daarna worden axenische eieren verkregen. Op dit punt moet de zeef met de eieren worden ondergedompeld in EtOH.
OPMERKING: Om een grondige sterilisatie te garanderen, gebruikt u een pipet van 1 ml om NaClO en EtOH op te zuigen en de eieren te verspreiden. Herhaal het spoelproces meerdere keren. Deze stap zal het oppervlak van de eieren verder reinigen van resterende bacteriën en onzuiverheden, waardoor een schoon en steriel oppervlak wordt gegarandeerd.
3. Kweek van axenische larven
- Om de gesteriliseerde eieren over te brengen, gebruikt u een schaar die is gesteriliseerd met een alcohollamp om de eindpunt van een pipet van 1 ml af te knippen (Figuur 3B). Zorg ervoor dat de eindopening van de gesneden pipet groter is dan de diameter van de eieren (ongeveer 2 mm). Gebruik vervolgens de pipet om de eieren van de EtOH-oplossing (eieren samen met de oplossing) (Figuur 3C) over te brengen naar een centrifugebuis met de steriele diëten, en elk buisje moet ongeveer 20-50 eieren bevatten (Figuur 3D). Herhaal dit proces totdat alle eieren zijn overgeplaatst.
OPMERKING: De diameter van de pipetpunt moet zo groot mogelijk zijn om te voorkomen dat de eieren tijdens de overdracht breken, wat tot de dood kan leiden. - Gebruik een pipet om overtollige ethanol uit de buis te verwijderen. Plaats de centrifugebuis gesloten met deksels in een zelfsluitende zak en plaats een stuk katoen bij de opening van de zak om luchtcirculatie mogelijk te maken. Plaats de zak ten slotte in een incubator van 25 °C (relatieve vochtigheid: 50%-70%; fotoperiode: 16 uur licht: 8 uur donker) voor observatie en teelt.
- Ongeveer drie dagen later beginnen de axenische eieren in de diëten uit te komen (Figuur 4A). De uitgekomen larven zullen actief zijn en het oppervlak van de steriele diëten zal niet langer glad zijn. De larven zullen zich gaan voeden met de voeding.
- Blijf de larven observeren totdat ze het stadium van 2e instar-larven bereiken. Blijf hun groei en ontwikkeling in deze periode volgen.
- Na 9-12 dagen heeft meer dan 80% van de eitjes zich ontwikkeld tot 3e instarlarven (Figuur 4B). Dit duidt op een succesvolle groei en ontwikkeling van de larven.
4. Validatie van axenische larven met kweekafhankelijke assays
- Selecteer willekeurig drie axenische 3e instar-larven uit de centrifugebuis.
- Plaats de larven in een petrischaaltje van 94 mm x 16 mm met 75% alcohol om te reinigen. Breng ze daarna over in een bak met steriel water om verder te spoelen.
- Gebruik een gedesinfecteerde ontleedtang die is gesteriliseerd met 75% EtOH-oplossing om de larven vast te pakken (de kop en staart zijn weergegeven in figuur 5A). Gebruik een ontleedschaar om de kop en de staartuiteinden te verwijderen (Figuur 5B). Houd de staart van de larven vast met de pincet en gebruik een andere pincet om voorzichtig van de staart naar de kop te knijpen en de inwendige organen eruit te halen (het resultaat weergegeven in figuur 5C). Plaats de inwendige organen in gedeïoniseerd water en trek de darm voorzichtig los door met een tang op het vetweefsel te drukken, en plaats de geëxtraheerde inwendige (Figuur 5D) in steriel water voor verder gebruik.
- Plaats de darm in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml, voeg 500 μL gesteriliseerde 1x PBS-buffer toe en gebruik een wegwerpstamper om het darmweefsel tot een homogenaat te malen.
- Neem 100 μL van het homogenaat en voeg het toe aan een voedingsagarmedium. Gebruik een L-vormige spreider (zie Tabel met materialen) voor het strepen van de agarplaat.
- Plaats de petrischaal in een biochemische incubator bij 28 °C en incubeer gedurende 72 uur om de groei van kolonies te observeren.
5. Validatie van axenische larven met kweekonafhankelijke assays
- Extraheer totaal DNA uit het darmweefsel van axenische larven met behulp van een DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
- Meet de DNA-concentratie met behulp van een UV-spectrofotometer.
- Voer een PCR-reactie uit met behulp van universele bacteriële 16S rRNA-primers (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Het totale reactievolume is 25 μL en bestaat uit 1 μL DNA-sjabloon, 0,5 μL voorwaartse primer, 0,5 μL omgekeerde primer, 10,5 μL ddH2O en 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (zie Materiaaltabel). Stel de PCR-reactiecondities als volgt in: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 3 minuten; 35 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 90 s; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 min. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C voor verdere analyse.
- Voer een PCR-reactie uit met behulp van universele schimmel-ITS-primers (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Het totale reactievolume is 25 μL en bestaat uit 1 μL DNA-sjabloon, 0,5 μL voorwaartse primer, 0,5 μL omgekeerde primer, 10,5 μL ddH2O en 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Stel de PCR-omstandigheden in op 95 °C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 90 s; gevolgd door 72 °C gedurende 10 min. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C voor verdere analyse.
- Gebruik Super Green nucleïnezuurkleurstof (zie Materiaaltabel) om gelijkmatig te mengen met elk van de twee soorten PCR-producten en analyseer ze door elektroforese op een 1% agarosegel in 1x TAE-buffer (verdund van 50x TAE, zie Materiaaltabel). Gebruik 3 μL DNA-marker (zie Materiaaltabel) als referentie.
- Gebruik een UV-transilluminator om de gel te observeren en het doelfragment te lokaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De levensfasen van D. antiqua zijn weergegeven in figuur 4. De volledige levenscyclus bestaat uit eieren, larven, poppen (Figuur 4C) en volwassen dieren (Figuur 4D). Ze worden gekweekt in steriele centrifugebuizen en hun uiterlijk en overlevingskans zijn niet te onderscheiden van D. antiqua die onder niet-axenische omstandigheden wordt gekweekt. De groei- en ontwikkelingstijden voor elk stadium van D. antiqua zijn te vinden in figuur 6. Het eistadium van niet-axenisch gekweekte D. antiqua is 2,83 ± 0,29 dagen, en dat van axenisch gekweekte D. antiqua is 2,83 ± 0,29 dagen, zonder significant verschil tussen de twee (onafhankelijke t-toets, t = 0,00, p = 1,00). Het normale larvale stadium duurt 13,83 ± 0,76 dagen, terwijl het axenische larvale stadium 14,50 ± 0,50 dagen duurt, zonder significant verschil tussen de twee (onafhankelijke t-toets, t = 1,27, p = 0,27). Het popstadium van normaal gekweekte D. antiqua is 17,33 ± 0,76 dagen, en dat van axenisch gekweekte D. antiqua is 18,00 ± 0,50 dagen, zonder significant verschil tussen de twee (onafhankelijke t-toets, t = 1,27, p = 0,27). De overlevingstijd van volwassen dieren is 81,50 ± 1,00 dagen voor normale opfok en 80,33 ± 0,76 dagen voor axenische grootkweek, zonder significant verschil tussen de twee (onafhankelijke t-toets, t = 1,61, p = 0,18). Er kan worden waargenomen dat er geen significant verschil is in de ontwikkelingstijd tussen axenische D. antiqua en D. antiqua die onder normale omstandigheden worden grootgebracht.
Kweekafhankelijke testen toonden aan dat er geen kolonies werden gedetecteerd in de larvale darmen (Figuur 7). Bovendien onthulde PCR-analyse op basis van bacterieel 16S-rRNA de aanwezigheid van een band rond 1500 bp (Figuur 8A), geïdentificeerd als Wolbachia (het GenBank-toetredingsnummer voor deze nucleotidesequentie is: OR564190), een endosymbiotische bacterie. Er werden echter geen banden waargenomen in de PCR-analyse gericht op ITS-regio's van schimmels (Figuur 8B). Dit geeft aan dat de larven een axenische toestand hebben bereikt. Axenische larven zijn van groot belang voor het bestuderen van de interactiemechanismen tussen D. antiqua en micro-organismen, evenals voor het voorkomen en beheersen van de schade veroorzaakt door D. antiqua.
Figuur 1: De kweekmiddelen en het voedsel voor D. antiqua. (A) Het witte deel van de lente-ui voor larven. (B) Waterdispenser voor volwassenen. (C) Voedsel voor volwassenen. D) Verzamelinrichting voor de eieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bestanddelen van de bereiding van diëten. (A) Gemalen lente-uitjes. (B) Gefermenteerde lente-uitjes. (C) Gefermenteerde lente-uitjesresten en filtraat. (D) Bereide diëten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het proces van eiceloverdracht. (A) Eieren in de celzeef. (B) Pinet van 1 ml zonder de eindpunt. (C) 1 ml pipet met eieren. (D) Eieren die in het voer worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Levensstadia van axenische D. antiqua. (A) Eieren. b) Larven. (C) Poppen. (D) Vrouwelijke en mannelijke volwassenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het proces van het ontleden van larvale darmen. (A) De kop en staart van de larve. (B) De larve waarvan de kop en de staart zijn verwijderd. (C) Gescheiden darm- en lichaamsweefsels. (D) Een intacte darm na dissectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Ontwikkelingstijd van elke groeifase van normaal gekweekte en axenisch gekweekte D. antiqua. Geen significant verschil in ontwikkelingstijd tussen axenisch gekweekte en normaal gekweekte D. antiqua. Onafhankelijke t-toets, p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bevestiging van de steriliteit van D. antiqua door willekeurig drie larven te selecteren en darmhomogenaten te incuberen op TSA- en PDA-agarplaten. Er werden geen bacteriën waargenomen in larven die steriele voeding kregen. (A) Axenische larven op TSA. (B) Normale larven op TSA. (C) Axenische larven op PDA. (D) Normale larven op PDA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Bevestiging van de steriliteit van D. antiqua door PCR-analyse met behulp van universele 16S rRNA-primers en schimmel-ITS-primers. De doelband van het 16S rRNA-gen is ~1.500 bp. Een band van ongeveer 1500 bp werd waargenomen en geïdentificeerd als de endosymbiotische bacterie Wolbachia. De doelband van het ITS-gen is 500-750 bp. Er werd geen doelband waargenomen in de AF-groepen. (A) 16S rRNA-elektroferogram. (B) ZIJN elektroferogram. Afkortingen: M = marker; NC = negatieve controle; NF = normale voeding; AF = axenische voeding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insecten bezitten een zeer complexe darmmicrobiota20,21, waardoor het gebruik van axenische insecten die zijn geïnoculeerd met specifieke darmmicrobiële stammen noodzakelijk is voor het bestuderen van interacties tussen insecten en micro-organismen. De bereiding van axenische insecten is cruciaal voor dergelijke onderzoeksinspanningen. Antibioticabehandeling is een methode die wordt gebruikt om de darmmicrobiota te elimineren. Jung en Kim22 voedden Spodoptera exigua bijvoorbeeld met penicilline, terwijl Raymond23 P. xylostella voedde met een kunstmatig dieet met rifampicine om de darmbacteriën te verwijderen. Behandeling met antibiotica kan darmbacteriën echter niet volledig elimineren en heeft veel bijwerkingen op gastheerinsecten. Deze omvatten veranderingen in metabole enzymactiviteit, verminderde darmfunctie, remming van groei, ontwikkeling en voortplanting, evenals verhoogde sterftecijfers 23,24,25. Bijgevolg kan de functionaliteit van de darmmicrobiota van insecten worden gemaskeerd na een behandeling met antibiotica. Gelukkig kan dit probleem worden opgelost door het oppervlak van de eieren chemisch te desinfecteren, waardoor de productie van axenische insecten relatief gemakkelijk kan worden16. Ter vergelijking: de combinatie van oppervlaktedesinfectie van de eieren gevolgd door voeding met steriele diëten is effectiever en haalbaarder dan antibioticabehandeling26,27.
Het verkrijgen van axenische D. antiqua is voornamelijk afhankelijk van het gebruik van axenische eieren en steriele diëten. In vergelijking met andere insectensoorten zijn de eitjes van D. antiqua relatief klein. Eerder gebruikte desinfectiemethoden, zoals het kort weken van de eieren in 0,1% natriumdodecylbenzeensulfonaat gevolgd door een behandeling van 5 minuten met een 2% waterstofperoxide-oplossing om axenische kakkerlakkeneierente verkrijgen 28, of het gebruik van een 10% natriumhypochlorietoplossing gedurende 10 minuten om eieren van de rode palmkever29 aan de oppervlakte te desinfecteren, zijn niet geschikt voor het desinfecteren van D. antiqua eieren. Er bestaan eerdere studies over de desinfectie van eieren van Diptera-soorten, zoals het gebruik van waterstofperoxide-oplossingen die worden gebruikt als handdesinfectiemiddel en waterstofperoxide als oppervlaktedesinfectiemiddel om Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) eieren te steriliseren30. Daarom wordt het optimaliseren van de keuze van desinfectiemiddel en desinfectietijd noodzakelijk. Na experimenten is gebleken dat het gebruik van 0,26% NaClO en 75% EtOH, het desinfecteren van de eieren gedurende 0,5 minuut en het drie keer herhalen van het proces sterilisatie van D. antiqua-eieren kan bereiken.
Na het verkrijgen van axenische eieren, is een ander cruciaal aspect van het kweken van axenische D. antiqua het verstrekken van steriele diëten voor de larven in vitro. Hoewel kunstmatige diëten natuurlijk voedsel niet volledig kunnen repliceren, hebben studies 31,32,33 de haalbaarheid aangetoond van het kweken van insecten met behulp van kunstmatige diëten. De voedingswaarde van kunstmatige diëten kan het immuunsysteem en het aanpassingsvermogen van insecten beïnvloeden34. Daarom is het belangrijk dat kunstmatig bereide diëten vergelijkbare voedingscomponenten bevatten als natuurlijke voeding. Dit zal ervoor zorgen dat de gekweekte insecten de nodige voedingsstoffen krijgen voor hun ontwikkeling, immuunrespons en algehele gezondheid. In deze studie dienen lente-uitjes als het primaire bestanddeel van steriele diëten voor D. antiqua. Halfgefermenteerde diëten bieden betere voedingsstoffen voor D. antiqua, wat bijdraagt aan hun groei en ontwikkeling. Bovendien heeft het mengen van het larvale homogenaat met de diëten tot doel de voorvertering van de diëten door de darmmicrobiota buiten het lichaam te vergemakkelijken. Dit komt omdat darmbacteriën een effect hebben op de voeding en spijsvertering van insecten35. Het gebruik van deze methode om steriele diëten voor D. antiqua te bereiden, vereenvoudigt het proces en verbetert de efficiëntie van de dieetbereiding aanzienlijk.
Bacteriële symbionten die door de moeder in cellen worden overgedragen, zijn op grote schaal aanwezig bij insecten36. Wolbachia, een intracellulaire bacterie die door de moeder wordt overgedragen, is aanwezig in tal van insecten37. Wolbachia is het meest bekend om zijn rol bij reproductieve manipulatie, omdat het de geslachtsverhouding van de nakomelingen van de gastheer kan beïnvloeden in de richting van het produceren van meer geïnfecteerde vrouwtjes. Na verificatie van de axenische toestand van D. antiqua-larven , bleek dat de larven na desinfectie in wezen axenisch waren, met uitzondering van de endosymbiotische bacterie Wolbachia, aanwezig in het cytoplasma van eierstokweefselcellen in D. antiqua en verticaal overgedragen over generaties via het cytoplasma van eicellen. Wat betreft de methode om Wolbachia te elimineren, is behandeling met antibiotica een gebruikelijke aanpak. Samengevat presenteert dit artikel een methode voor het kweken van axenische D. antiqua. Volgens het protocol kan axenic D. antiqua met succes worden gekweekt. Bovendien wordt deze methode gekenmerkt door zijn eenvoud en lage kosten, waardoor een nieuwe benadering wordt geboden voor het kweken van andere axenische insecten en de haalbaarheid van het bestuderen van de interacties tussen insecten en darmmicrobiota wordt vergroot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32272530), het New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in de provincie Shandong (2021TZXD002) en het Science and Education Integration Project van Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
