Summary
Une procédure simple pour l’élevage de Delia antiqua axénique avec des aliments stériles semi-fermentés est décrite. Une seule souche de Wolbachia a été détectée dans chaque stade de D. antiqua axénique par PCR.
Abstract
Les insectes axéniques sont obtenus à partir de systèmes d’élevage artificiels stériles utilisant des milieux stériles. Ces insectes, caractérisés par leur petite taille, leur cycle de croissance court et leurs faibles besoins alimentaires, sont idéaux pour étudier la relation entre les micro-organismes et les hôtes. Le microbiote intestinal influence de manière significative les caractéristiques physiologiques des insectes hôtes, et l’introduction de souches spécifiques dans les insectes axéniques fournit une méthode pour vérifier les fonctions microbiennes intestinales. Delia antiqua, un ravageur menaçant de l’ordre des Diptères, de la famille des Anthomyiidae et du genre Delia, se nourrit principalement d’oignons, d’ail, de poireaux et d’autres légumes de la famille des Liliacées. Ses larves se nourrissent des bulbes, provoquant la pourriture, le flétrissement et même la mort de plantes entières. L’élevage de larves axéniques permet d’effectuer des études de suivi afin d’observer les effets de la microflore intestinale sur la croissance et le développement de D. antiqua. Contrairement à la méthode d’élimination des microbes associés par des antibiotiques, cet article présente une approche peu coûteuse et très efficace pour élever D. antiqua axénique. Après la stérilisation superficielle des œufs de D. antiqua , des aliments stériles semi-fermentés ont été utilisés pour élever les larves, et l’état axénique de D. antiqua a été vérifié par des essais dépendants et indépendants de la culture. En conclusion, la combinaison de la stérilisation des œufs d’insectes et de la préparation d’aliments stériles pour la culture larvaire a permis le développement d’une méthode efficace et simple d’obtention de D. antiqua axénique. Cette méthode fournit une approche puissante pour étudier les interactions entre les insectes et la microflore.
Introduction
Les animaux axéniques, définis comme des animaux chez lesquels aucun micro-organisme ou parasite viable ne peut être détecté, sont des modèles expérimentaux précieux pour étudier les interactions hôte-micro-organisme 1,2. Les insectes, le plus grand groupe d’invertébrés, peuvent former des relations symbiotiques avec des micro-organismes3. Les insectes axéniques peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-symbiote dans les systèmes symbiotiques4. Par exemple, Nishide et al.5 ont mis au point une procédure pratique d’élevage stérile pour le ver malodorant Plautia stali, permettant une analyse fiable et rigoureuse des interactions hôte-symbiote dans des systèmes symbiotiques modèles. Les insectes axéniques peuvent être produits en stérilisant le stade de l’œuf et en fournissant de la nourriture stérile aux larves et aux adultes 6,7. Les insectes axéniques sont d’une grande importance et sont largement utilisés dans la recherche biologique. Par exemple, une étude menée par Somerville et al.8 a démontré que les fausses-teignes des crucifères inoculées avec Enterobacter cloacae amélioraient la capacité d’adaptation des mâles transgéniques.
Delia antiqua Meigen est un ravageur économiquement important des oignons et d’autres cultures de Liliacées dans le monde entier, ses larves endommageant les bulbes d’oignons et d’autres cultures de Liliacées9. D. antiqua se trouve principalement dans les climats tempérés et est répandu dans les zones de culture de l’oignon des Amériques, d’Europe et d’Asie. Si elle n’est pas correctement contrôlée, elle peut entraîner des pertes de récolte d’oignons (Allium cepa L.), d’ail (Allium sativum L.), d’échalotes (Allium fistulosum L.) et de poireaux (Alliumchoenoprasum L.) allant de 50 % à 100 %10,11. Les larves se nourrissent des parties souterraines des plantes, et cette alimentation provoque le flétrissement et la mort des plantules. De plus, les plantes endommagées peuvent permettre aux agents pathogènes d’entrer, ce qui entraîne la pourriture des bulbes12. Même si les plants ne sont pas complètement consommés par les larves, les dommages qu’elles causent rendent les plants d’oignon invendables et entraînent des pertes économiques.
Les insectes sont étroitement associés au microbiote intestinal, et la plupart des intestins d’insectes contiennent une variété de bactéries symbiotiques qui se développent grâce aux nutriments fournis par l’hôte13,14. Jing et al.15 ont montré que la fonction première de la communauté symbiotique intestinale est de fournir des nutriments essentiels, suivis par des fonctions liées à la digestion et à la détoxification. Dans certains cas, les bactéries intestinales peuvent servir de ressource microbienne à des fins de lutte antiparasitaire. Par conséquent, il est souhaitable d’étudier les performances et les fonctions spécifiques des bactéries intestinales individuelles dans le corps de D. antiqua. Par conséquent, la préparation des larves axéniques est particulièrement importante pour étudier les interactions entre des souches bactériennes spécifiques et des insectes16. Actuellement, une méthode couramment utilisée pour éliminer les bactéries intestinales des insectes est l’utilisation d’une combinaison d’antibiotiques pour éradiquer les microbes associés 17,18,19. Contrairement à l’utilisation d’antibiotiques seuls, qui ne peuvent que réduire le nombre de microbes, l’élevage axénique des insectes permet de contrôler la composition et la quantité de micro-organismes, ce qui permet une validation plus précise de la fonctionnalité du microbiote intestinal.
Ainsi, cet article présente un protocole de préparation et d’élevage axénique de D. antiqua. La nourriture larvaire axénique est obtenue en utilisant la stérilisation à haute température des aliments naturels combinés à des aliments semi-fermentés. Les œufs sont stérilisés selon un protocole expérimental pour obtenir des œufs axéniques, et enfin, des larves axéniques sont cultivées à partir des œufs axéniques. Le système d’élevage axénique n’a été réalisé que pendant une génération pour l’expérience. Cela facilitera l’étude de l’interaction entre les insectes et le microbiote intestinal.
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Protocol
D. antiqua sont obtenus dans le champ de Fanzhen, Taian.
1. Préparation d’aliments stériles
- Décollez les couches extérieures des oignons verts et jetez les feuilles vertes. Conservez la partie blanche des oignons verts (figure 1A) et lavez-les à l’eau stérile, en répétant le processus de rinçage trois fois. Coupez la partie blanche des oignons verts en dés de 1 à 2 cm à l’aide de ciseaux (voir tableau des matériaux) stérilisés avec une solution d’EtOH à 75 % (mentionnée à l’étape 2.5) pour une utilisation ultérieure.
- Pesez 50 g d’oignons verts coupés en dés et placez-les dans un robot culinaire (voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 ml d’eau stérilisée et les broyer cinq fois pendant 2 minutes chacune. Tous les oignons verts coupés en dés doivent être broyés jusqu’à obtenir une consistance pâteuse (figure 2A).
- À l’aide d’une pince à épiler, transférer 10 larves de 3e stade de D. antiqua dans un tube à centrifuger de 10 mL contenant 10 mL de PBS 1x et les broyer à l’aide d’un pilon à broyer jetable (voir le tableau des matériaux) pendant environ 5 min pour obtenir un liquide de broyage larvaire.
- Verser le liquide pâteux à l’oignon vert et le liquide de broyage des larves dans une fiole conique propre de 500 mL (voir le tableau des matériaux). Envelopper l’embouchure conique de la fiole avec deux couches de film d’étanchéité transparent, puis placer la fiole dans un incubateur à agitation (voir tableau des matériaux) pour la fermentation à 25 °C et 180 tr/min pendant 12 h (figure 2B).
- Découpez sept couches de gaze carrée de 10 cm de côté (pas besoin de stérilité) avec des ciseaux et empilez-les ensemble pour former un simple dispositif de filtration. Versez lentement le liquide d’oignon vert fermenté sur la gaze et pressez le liquide filtré dans une nouvelle fiole conique de 500 ml. Enveloppez les résidus d’oignons verts restants sur la gaze dans du papier d’aluminium pour une utilisation ultérieure.
- Filtrer le filtrat obtenu à l’étape précédente à l’aide d’une pompe à vide (voir tableau des matériaux) et d’un entonnoir Buchner. Placez le papier filtre mouillé par de l’eau déminéralisée sur l’entonnoir Buchner, puis versez le filtrat et effectuez une filtration par aspiration trois fois avec du papier filtre différent. Prélever le filtrat final dans la fiole conique de 500 ml.
- Effectuez une autre filtration à l’aide d’un flacon filtrant de 0,22 μM et d’une pompe à vide. Vissez le couvercle de la fiole du filtre d’aspiration dans un banc ultra-propre (voir tableau des matériaux) pour une utilisation ultérieure. À ce stade, on obtient le résidu d’oignon vert fermenté et le filtrat (figure 2C).
REMARQUE : Le liquide filtré obtenu à partir de cette étape sera stérile. (Le flacon filtrant de 0,22 μM est un système stérile de filtration sous vide pour la stérilisation du filtrat). - Répétez les étapes précédentes pour obtenir des résidus d’oignons verts non fermentés et du filtrat. Ici, la différence est que la fermentation n’est pas nécessaire.
- Peser 0,24 g de chlorure de choline et 0,56 g d’acide L-ascorbique (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 10 ml. Ajouter 3 mL d’eau déminéralisée et agiter vigoureusement jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous. Dans la paillasse ultra-propre, utilisez une nouvelle seringue de 5 mL et fixez trois filtres de seringue de 0,22 μM (voir le tableau des matériaux) pour stériliser la solution, puis placez-la dans un tube à centrifuger stérile de 10 mL pour une utilisation ultérieure.
REMARQUE : Le chlorure de choline est un neurotransmetteur essentiel pour la croissance des insectes, tandis que l’acide L-ascorbique agit comme un conservateur. - Peser 2 g de poudre d’agar et 6 g de TSB (voir tableau des matériaux) et les verser dans une fiole conique de 500 ml. Ajoutez ensuite 100 mL d’eau déminéralisée pour préparer le milieu de culture. Après avoir rincé la tige de verre avec de l’eau déminéralisée, utilisez-la pour remuer le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Ensuite, scellez la fiole conique à l’aide de deux couches de film d’étanchéité transparent.
- Enveloppez les oignons verts fermentés et les oignons verts non fermentés (mentionnés aux étapes 1.5 et 1.8) dans du papier d’aluminium et stérilisez-les, ainsi que le milieu de culture, dans un autoclave à 121 °C pendant 20 min.
- Dans la paillasse ultra-propre, versez le chlorure de choline stérilisé, l’acide L-ascorbique et le filtrat stérile dans le milieu de culture tout en remuant doucement pour bien les mélanger. Enfin, ajoutez les oignons verts fermentés et non fermentés et secouez vigoureusement à la main pour obtenir les aliments stériles. Verser les rations dans les tubes à centrifuger de 50 mL (stériles ; bouchon d’évent avec membrane hydrophobe en PVDF de 0,22 μM) (voir le tableau des matériaux) en biais (figure 2D).
REMARQUE : Après la stérilisation, la température du milieu de culture doit être maintenue entre 65 et 80 °C pour éviter un refroidissement et une solidification rapides lors de l’ajout d’oignons verts ou d’autres ingrédients. De plus, dans chaque tube, versez environ 10 à 15 ml de régimes. Une fois les aliments solidifiés, conservez les tubes au réfrigérateur à 4 °C, s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.
2. Acquisition d’ovules axéniques
- Système d’élevage en laboratoire pour D. antiqua
- Placez une cage d’élevage dans un incubateur éclairé par LED à 25 °C (24 h par cycle, le rapport entre la lumière et l’obscurité est de 16 :8) pour élever les adultes mâles et femelles, leur permettant de s’accoupler et de pondre des œufs. Remplissez le distributeur d’eau (figure 1B) d’eau et scellez-le avec du coton humidifié pour fournir de l’eau aux adultes.
- Placez quatre fonds de boîtes de Pétri de 35 mm x 12 mm dans un couvercle de boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm. Mouillez le coton avec de l’eau ionisée, puis placez du coton humide au fond de deux des boîtes de Pétri, et sur le coton, ajoutez une cuillère à soupe de saccharose.
- Remplissez les deux autres fonds de boîtes de Pétri avec deux cuillères à soupe de saccharose et d’extrait de levure (voir le tableau des matériaux), qui servent de nourriture aux insectes adultes (figure 1C).
REMARQUE : Le saccharose et l’extrait de levure mentionnés à l’étape 2.1.2 et à l’étape 2.1.3 n’ont pas besoin d’être stérilisés. - Placez un fond de boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant du sable humidifié et un morceau de gousse d’ail pelée et non enracinée (figure 1D) à l’intérieur de la cage à mouches pour recueillir les œufs. La femelle sera attirée par l’odeur de l’ail et pondra des œufs autour de celui-ci.
- Collecte des oeufs
- Sortez de la cage le dispositif de ponte, qui est une boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant du sable et de l’ail (étape 2.14). Versez le sable avec l’ail dans un bécher de 500 ml et utilisez de l’eau du robinet pour rincer les œufs restants de l’ail dans le bécher. À ce stade, les œufs flottent dans l’eau.
- Prenez un tamis de 100 mailles (voir le tableau des matériaux) et humidifiez-le avec de l’eau du robinet. Versez ensuite l’eau contenant les œufs flottants du bécher sur le tamis. Les œufs resteront sur le tamis.
- Une fois que les œufs ont séché naturellement sur le tamis, utilisez un pinceau pour balayer doucement les œufs sur une boîte de Pétri.
- Le premier jour, rincez le dispositif de ponte pour recueillir les œufs sans désinfection ni stérilisation. Le deuxième jour, à quatre heures de l’après-midi, rincez à nouveau les œufs et ramassez-les en les tamisant à l’eau claire.
REMARQUE : La collecte des œufs le deuxième jour permet d’assurer un taux de croissance constant dans les étapes suivantes. Quatre heures de l’après-midi, c’est le pic de ponte de D. antiqua. Ainsi, il est idéal de collecter les œufs à ce moment-là. - Placez les œufs collectés sur un tamis à cellules stériles (voir le tableau des matériaux) dans la paillasse ultra-propre (figure 3A).
- Préparer la solution pour la stérilisation des ovules
- Prélever 5 mL de NaClO à 5,2 % (voir le tableau des matériaux) et le transférer dans une fiole conique stérilisée de 250 mL. Ajouter 95 mL d’eau stérilisée pour obtenir un volume total de 100 mL, ce qui donne une solution à 0,26 % de NaClO.
- Pour préparer une solution d’EtOH à 75 %, prélever 75 mL d’EtOH à 99,7 % et le transférer dans une fiole conique stérilisée de 250 mL. Ajouter 25 mL d’eau stérilisée pour obtenir un volume total de 100 mL, ce qui donne une solution d’EtOH à 75 %.
- Versez 30 mL de NaClO dans une boîte de Pétri et versez 30 mL d’EtOH dans une autre boîte de Pétri. Placez le tamis contenant les œufs mentionnés à l’étape 2.4 dans le plat contenant du NaClO. Faites-le tremper dans la solution de NaClO à 0,26 % pendant 0,5 min. Transférez ensuite le tamis dans le plat contenant de l’EtOH, en le laissant tremper dans la solution d’EtOH à 75 % pendant 0,5 minute supplémentaire.
- Répétez ce processus trois fois, en alternant entre 0,26 % de NaClO et 75 % d’EtOH toutes les 0,5 min. Après cela, des œufs axéniques seront obtenus. À ce stade, le tamis contenant les œufs doit être immergé dans l’EtOH.
REMARQUE : Pour assurer une stérilisation complète, utilisez une pipette de 1 ml pour aspirer le NaClO et l’EtOH et disperser les ovules. Répétez le processus de rinçage plusieurs fois. Cette étape permettra de nettoyer davantage la surface des œufs des bactéries et des impuretés résiduelles, garantissant ainsi une surface propre et stérile.
3. Élevage de larves axéniques
- Pour transférer les ovules stérilisés, utilisez une paire de ciseaux stérilisés à l’aide d’une lampe à alcool pour couper l’extrémité d’une pipette de 1 ml (figure 3B). Assurez-vous que l’ouverture de l’extrémité de la pipette coupée est plus grande que le diamètre des œufs (environ 2 mm). Ensuite, utilisez la pipette pour transférer les œufs de la solution d’EtOH (les œufs avec la solution) (Figure 3C) vers un tube à centrifuger contenant les aliments stériles, et chaque tube devrait contenir environ 20 à 50 œufs (Figure 3D). Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les ovules aient été transférés.
REMARQUE : Le diamètre de la pointe de la pipette doit être aussi grand que possible pour éviter de casser les ovules pendant le transfert, ce qui pourrait entraîner leur mort. - Utilisez une pipette pour éliminer tout excès d’éthanol du tube. Placez le tube de centrifugation fermé avec des couvercles à l’intérieur d’un sac auto-obturant et placez un morceau de coton à l’ouverture du sac pour permettre la circulation de l’air. Enfin, placez le sac dans un incubateur à 25 °C (humidité relative : 50 %-70 % ; photopériode : 16 h lumière : 8 h obscurité) pour l’observation et la culture.
- Environ trois jours plus tard, les œufs axéniques des régimes commencent à éclore (figure 4A). Les larves écloses seront actives et la surface des aliments stériles ne sera plus lisse. Les larves commenceront à se nourrir des régimes.
- Continuez d’observer les larves jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de larves du 2estade. Continuez à surveiller leur croissance et leur développement pendant cette période.
- Après 9 à 12 jours, plus de 80 % des œufs se sont transformés en larves du 3estade (figure 4B). Cela indique une croissance et un développement réussis des larves.
4. Validation des larves axéniques avec des tests dépendants de la culture
- Sélectionner au hasard trois larves axéniques de 3e stade dans le tube à centrifuger.
- Placez les larves dans une boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant 75 % d’alcool pour le nettoyage. Après cela, transférez-les dans un récipient avec de l’eau stérile pour un rinçage supplémentaire.
- Utiliser une pince à dissection désinfectée qui a été stérilisée avec une solution d’EtOH à 75 % pour saisir les larves (la tête et la queue sont illustrées à la figure 5A). Utilisez des ciseaux à dissection pour retirer les extrémités de la tête et de la queue (figure 5B). Tenez la queue des larves avec la pince et utilisez une autre pince pour presser doucement de la queue à la tête et extraire les organes internes (le résultat illustré à la figure 5C). Placez les organes internes dans de l’eau déminéralisée et retirez doucement l’intestin en appuyant sur le tissu adipeux avec une pince, puis placez l’organe interne extrait (Figure 5D) dans de l’eau stérile pour une utilisation ultérieure.
- Placez l’intestin dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml, ajoutez 500 μL de tampon PBS 1x stérilisé et utilisez un pilon jetable pour broyer le tissu intestinal en un homogénat.
- Prenez 100 μL de l’homogénat et ajoutez-le dans un milieu gélosé nutritif. Utilisez un épandeur en forme de L (voir tableau des matériaux) pour strier la plaque de gélose.
- Placez la boîte de Pétri dans un incubateur biochimique à 28 °C et incubez pendant 72 h pour observer la croissance des colonies.
5. Validation des larves axéniques avec des tests indépendants de la culture
- Extraire l’ADN total du tissu intestinal des larves axéniques à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
- Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
- Effectuer une réaction PCR à l’aide d’amorces universelles d’ARNr bactérien 16S (1492R : 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F : 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Le volume total de la réaction est de 25 μL et se compose d’une matrice d’ADN de 1 μL, d’une amorce directe de 0,5 μL, d’une amorce inverse de 0,5 μL, de 10,5 μL de ddH2O et de 12,5 μL de 2x Taq PCR Master Mix (voir le tableau des matériaux). Régler les conditions de réaction PCR comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, de recuit à 55 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 90 s ; extension finale à 72 °C pendant 10 min. Conservez les produits PCR à 4 °C pour une analyse plus approfondie.
- Effectuer une réaction PCR à l’aide d’amorces ITS fongiques universelles (ITS1 : 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4 : 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Le volume total de la réaction est de 25 μL et se compose d’une matrice d’ADN de 1 μL, d’une amorce directe de 0,5 μL, d’une amorce inverse de 0,5 μL, de 10,5 μL ddH2O et de 12,5 μL de 2x Taq PCR Master Mix. Réglez les conditions PCR à 95 °C pendant 5 min ; 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 90 s ; suivi de 72 °C pendant 10 min. Conservez les produits PCR à 4 °C pour une analyse plus approfondie.
- Utilisez le colorant d’acide nucléique Super Green (voir le tableau des matériaux) pour mélanger uniformément avec chacun des deux types de produits PCR, et analysez-les par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon 1 x TAE (dilué à partir de 50 x TAE, voir le tableau des matériaux). Utiliser 3 μL de marqueur d’ADN (voir le tableau des matériaux) comme référence.
- Utilisez un transilluminateur UV pour observer le gel et localiser le fragment cible.
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Representative Results
Les stades de développement du D. antiqua sont illustrés à la figure 4. Le cycle de vie complet comprend les œufs, les larves, les pupes (figure 4C) et les adultes (figure 4D). Ils sont cultivés dans des tubes à centrifuger stériles, et leur apparence et leur taux de survie sont impossibles à distinguer de ceux de D. antiqua élevés dans des conditions non axéniques. Les temps de croissance et de développement de chaque stade de D. antiqua sont présentés à la figure 6. Le stade de l’œuf chez D . antiqua élevé non axéniquement est de 2,83 ± 0,29 jour, et celui de D. antiqua élevé vers l’axe est de 2,83 ± 0,29 jour, sans différence significative entre les deux ( test t indépendant, t = 0,00, p = 1,00). Le stade larvaire normal dure de 13,83 ± 0,76 jour, tandis que le stade larvaire axénique dure de 14,50 ± 0,50 jour, sans différence significative entre les deux ( test t indépendant, t = 1,27, p = 0,27). Le stade nymphal de D. antiqua élevé normalement est de 17,33 ± 0,76 jour, et celui de D. antiqua élevé de manière axénique est de 18,00 ± 0,50 jours, sans différence significative entre les deux ( test t indépendant, t = 1,27, p = 0,27). Le temps de survie des adultes est de 81,50 ± 1,00 jours pour un élevage normal et de 80,33 ± 0,76 jours pour un élevage axénique, sans différence significative entre les deux ( test t indépendant, t = 1,61, p = 0,18). On peut observer qu’il n’y a pas de différence significative dans le temps de développement entre D. antiqua axénique et ceux élevés dans des conditions normales.
Les tests dépendants de la culture ont montré qu’aucune colonie n’a été détectée dans les intestins des larves (Figure 7). De plus, l’analyse PCR basée sur l’ARNr bactérien 16S a révélé la présence d’une bande à environ 1500 pb (Figure 8A), identifiée comme Wolbachia (Le numéro d’accession GenBank pour cette séquence nucléotidique est : OR564190), une bactérie endosymbiotique. Cependant, aucune bande n’a été observée dans l’analyse PCR ciblant les régions fongiques des STI (figure 8B). Cela indique que les larves ont atteint l’état axénique. Les larves axéniques sont d’une grande importance pour l’étude des mécanismes d’interaction entre D. antiqua et les micro-organismes, ainsi que pour la prévention et le contrôle des dommages causés par D. antiqua.
Figure 1 : Les dispositifs d’élevage et la nourriture pour D. antiqua. (A) La partie blanche de l’oignon vert pour les larves. (B) Distributeur d’eau pour adultes. (C) Aliments pour adultes. (D) Dispositif de collecte des œufs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Composantes de la préparation des régimes. (A) Oignons verts moulus. (B) Oignons verts fermentés. (C) Résidus et filtrats d’oignons verts fermentés. (D) Régimes préparés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Processus de transfert des ovules. (A) Oeufs dans le tamis cellulaire. (B) Pipette de 1 mL sans l’embout. (C) 1 mL de pipette avec œufs. (D) Oeufs transférés dans les régimes alimentaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Stades de vie de D. antiqua. (A) Oeufs. (B) Larves. (C) Chrysalide. (D) Femmes et hommes adultes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Processus de dissection des intestins larvaires. (A) La tête et la queue de la larve. (B) La larve dont on a enlevé la tête et la queue. (C) Tissus intestinaux et corporels séparés. (D) Un intestin intact après dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Temps de développement de chaque stade de croissance de D. antiqua d’élevage normal et d’élevage axénique. Il n’y a pas de différence significative dans le temps de développement entre D. antiqua élevé axéniquement et D. antiqua normalement élevé. Test t indépendant, p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Confirmation de la stérilité de D. antiqua par sélection aléatoire de trois larves et incubation d’homogénats intestinaux sur des plaques de gélose TSA et PDA. Aucune bactérie n’a été observée chez les larves nourries avec des régimes stériles. (A) Larves axéniques sur TSA. (B) Larves normales sur TSA. (C) Larves axéniques sur PDA. (D) Larves normales sur PDA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Confirmation de la stérilité de D. antiqua par analyse PCR à l’aide d’amorces universelles à ARNr 16S et d’amorces ITS fongiques. La bande cible du gène de l’ARNr 16S est de ~1 500 pb. Une bande d’environ 1500 pb a été observée et identifiée comme étant la bactérie endosymbiotique Wolbachia. La bande cible du gène ITS est de 500 à 750 pb. Aucune bande cible n’a été observée dans les groupes AF. (A) Électrophérogramme de l’ARNr 16S. (B) Électrophérogramme ITS. Abréviations : M = marqueur ; NC = contrôle négatif ; NF = alimentation normale ; AF = alimentation axénique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les insectes possèdent un microbiote intestinal très complexe20,21, ce qui nécessite l’utilisation d’insectes axéniques inoculés avec des souches microbiennes intestinales spécifiques pour étudier les interactions insectes-microorganismes. La préparation d’insectes axéniques est cruciale pour de tels efforts de recherche. Le traitement antibiotique est une méthode utilisée pour éliminer le microbiote intestinal. Par exemple, Jung et Kim,22 ans, ont nourri Spodoptera exigua avec de la pénicilline, tandis que Raymond,23 ans, ont nourri P. xylostella avec un régime artificiel contenant de la rifampicine pour éliminer les bactéries intestinales. Cependant, le traitement antibiotique ne peut pas éliminer complètement les bactéries intestinales et a de nombreux effets secondaires sur les insectes hôtes. Il s’agit notamment de changements dans l’activité enzymatique métabolique, d’une altération de la fonction intestinale, d’une inhibition de la croissance, du développement et de la reproduction, ainsi que d’une augmentation des taux de mortalité 23,24,25. Par conséquent, la fonctionnalité du microbiote intestinal de l’insecte peut être masquée après un traitement antibiotique. Heureusement, ce problème peut être résolu en désinfectant chimiquement la surface des œufs, ce qui permet la production d’insectes axéniques avec une relative facilité16. Comparativement, la combinaison d’une désinfection superficielle des œufs suivie d’une alimentation avec des régimes stériles est plus efficace et réalisable qu’un traitement antibiotique26,27.
L’obtention de D. antiqua axénique repose principalement sur l’utilisation d’œufs axéniques et d’aliments stériles. Comparés à d’autres espèces d’insectes, les œufs de D. antiqua sont relativement petits. Les méthodes de désinfection précédemment utilisées, telles que le trempage brièvement des œufs dans du dodécylbenzène sulfonate de sodium à 0,1 %, suivi d’un traitement de 5 minutes avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 2 % pour obtenir des œufs de blattes axéniques28, ou l’utilisation d’une solution d’hypochlorite de sodium à 10 % pendant 10 minutes pour désinfecter en surface les œufs du charançon rouge du palmier29, ne conviennent pas à la désinfection de D. antiqua oeuf. Des études antérieures sur la désinfection des œufs d’espèces de diptères, telles que l’utilisation de solutions de peroxyde d’hydrogène utilisées comme désinfectant pour les mains et de peroxyde d’hydrogène comme désinfectant de surface pour stériliser les œufs de Lucilia sericata (Diptera : Calliphoridae)30, existent. Par conséquent, l’optimisation du choix du désinfectant et du temps de désinfection devient nécessaire. Après expérimentation, il a été constaté que l’utilisation de 0,26 % de NaClO et de 75 % d’EtOH, la désinfection des œufs pendant 0,5 minute et la répétition du processus trois fois peuvent permettre de stériliser les œufs de D. antiqua .
Après l’obtention d’œufs axéniques, un autre aspect crucial de l’élevage axénique de D. antiqua est de leur fournir des aliments stériles pour les larves in vitro. Bien que les régimes artificiels ne puissent pas reproduire entièrement les aliments naturels, les études 31,32,33 ont démontré la faisabilité de l’élevage d’insectes à l’aide de régimes artificiels. Le contenu nutritionnel des régimes alimentaires artificiels peut affecter le système immunitaire et la capacité d’adaptation des insectes34. Par conséquent, il est important que les régimes préparés artificiellement contiennent des composants nutritionnels similaires à ceux des aliments naturels. Cela aidera à s’assurer que les insectes élevés reçoivent les nutriments nécessaires à leur développement, à leur réponse immunitaire et à leur santé globale. Dans cette étude, les oignons verts constituent le principal composant des régimes stériles de D. antiqua. Les régimes semi-fermentés fournissent de meilleurs nutriments à D. antiqua, contribuant à leur croissance et à leur développement. De plus, le mélange de l’homogénat larvaire avec les régimes alimentaires vise à faciliter la pré-digestion des régimes par le microbiote intestinal à l’extérieur du corps. En effet, les bactéries intestinales ont un effet sur l’alimentation et la digestion des insectes35. L’utilisation de cette méthode pour préparer des aliments stériles pour D. antiqua simplifie le processus et améliore considérablement l’efficacité de la préparation des régimes.
Les symbiotes bactériens transmis par la mère au sein des cellules sont largement présents chez les insectes36. Wolbachia, une bactérie intracellulaire transmise par voie maternelle, est présente chez de nombreux insectes37. Wolbachia est surtout connu pour son rôle dans la manipulation de la reproduction, car il peut biaiser le sex-ratio de la progéniture de l’hôte en produisant plus de femelles infectées38. Après avoir vérifié l’état axénique des larves de D. antiqua , il a été constaté que les larves étaient essentiellement axéniques après désinfection, à l’exception de la bactérie endosymbiotique Wolbachia, présente dans le cytoplasme des cellules du tissu ovarien chez D. antiqua et transmise verticalement à travers les générations par le cytoplasme des ovules. En ce qui concerne la méthode d’élimination de Wolbachia, le traitement antibiotique est une approche courante. En résumé, cet article présente une méthode d’élevage axénique de D. antiqua. Selon le protocole, l’axénique D. antiqua peut être élevé avec succès. De plus, cette méthode se caractérise par sa simplicité et son faible coût, offrant une nouvelle approche pour l’élevage d’autres insectes axéniques et augmentant la faisabilité de l’étude des interactions entre les insectes et le microbiote intestinal.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32272530), le projet New Twenty Policies for University in Jinan (2021GXRC040), les grands projets d’innovation scientifique et technologique dans la province du Shandong (2021TZXD002) et le projet d’intégration de la science et de l’éducation de l’Université de technologie de Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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