Summary
En enkel prosedyre for oppdrett av aksenisk Delia antiqua med halvfermenterte sterile dietter er beskrevet. Bare en Wolbachia-stamme ble påvist i hver stjerne av aksenisk D. antiqua ved bruk av PCR.
Abstract
Akseniske insekter er hentet fra sterile kunstige oppdrettssystemer ved bruk av sterile medier. Disse insektene, preget av sin lille størrelse, korte vekstsyklus og lave fôrbehov, er ideelle for å studere forholdet mellom mikroorganismer og verter. Tarmmikrobiota påvirker signifikant de fysiologiske egenskapene til insektverter, og innføring av spesifikke stammer i akseniske insekter gir en metode for å verifisere tarmmikrobielle funksjoner. Delia antiqua, et truende i ordenen Diptera, familie Anthomyiidae og slekten Delia, lever primært av løk, hvitløk, purre og andre grønnsaker i familien Liliaceae. Larvene spiser på pærene, forårsaker rotting, visning og til og med død av hele planter. Ved oppdrett av akseniske larver kan oppfølgingsstudier utføres for å observere effekten av intestinal mikroflora på vekst og utvikling av D. antiqua. I motsetning til metoden som involverer antibiotikaeliminering av tilknyttede mikrober, presenterer denne artikkelen en billig og høyeffektiv tilnærming til å heve aksenisk D. antiqua. Etter overflatesterilisering av D. antiqua egg ble halvfermenterte sterile dietter brukt til å heve larver, og aksenisk tilstand av D. antiqua ble verifisert gjennom kulturavhengige og kulturuavhengige analyser. Avslutningsvis har kombinasjonen av insekteggsterilisering og fremstilling av sterile dietter for larvalkultur muliggjort utviklingen av en effektiv og enkel metode for å oppnå aksenisk D. antiqua. Denne metoden gir en kraftig tilnærming til å studere insekt-mikroflora-interaksjoner.
Introduction
Akseniske dyr, definert som dyr der ingen levedyktige mikroorganismer eller parasitter kan påvises, er verdifulle eksperimentelle modeller for å studere vertsmikroorganismeinteraksjoner 1,2. Insekter, den største gruppen av virvelløse dyr, kan danne symbiotiske forhold med mikroorganismer3. Akseniske insekter kan brukes til å studere vertssymbiontinteraksjoner i symbiotiske systemer4. For eksempel etablerte Nishide et al.5 en praktisk steril oppdrettsprosedyre for malodorormen Plautia stali, som muliggjorde pålitelig og streng analyse av vertssymbiontinteraksjoner i modellsymbiotiske systemer. Akseniske insekter kan produseres ved å sterilisere eggstadiet og gi steril mat til larver og voksne 6,7. Akseniske insekter er av stor betydning og er mye brukt i biologisk forskning. For eksempel viste en studie utført av Somerville et al.8 at diamondback møll inokulert med Enterobacter cloacae forbedret tilpasningsevnen til transgene hanner.
Delia antiqua Meigen er et økonomisk viktig på løk og andre Liliaceae-avlinger over hele verden, med larver som skader løkløkene og andre Liliaceae-avlinger9. D. antiqua finnes hovedsakelig i tempererte klimaer og er utbredt i løkdyrkingsområder i Amerika, Europa og Asia. Hvis det ikke kontrolleres riktig, kan det forårsake avlingstap i løk (Allium cepa L.), hvitløk (Allium sativum L.), sjalottløk (Allium fistulosum L.) og purre (Alliumchoenoprasum L.) fra 50% til 100%10,11. Larvene spiser på de underjordiske delene av planter, og denne fôringen får plantene til å visne og til slutt dø. I tillegg kan skadede planter tillate patogener å komme inn, noe som fører til pærerotting12. Selv om plantene ikke blir fullstendig fortært av larvene, gjør skaden de forårsaker løkplantene usalgbare og resulterer i økonomiske tap.
Insekter er nært forbundet med tarmmikrobiota, og de fleste insekttarmer inneholder en rekke symbiotiske bakterier som trives på næringsstoffene fra verten13,14. Jing et al.15 viste at den primære funksjonen til det intestinale symbiotiske samfunnet er å gi essensielle næringsstoffer, etterfulgt av funksjoner knyttet til fordøyelse og avgiftning. I visse tilfeller kan tarmbakterier tjene som en mikrobiell ressurs for skadedyrsbekjempelse. Følgelig er det ønskelig å studere de enkelte tarmbakterienes ytelser og spesifikke funksjoner i kroppen av D. antiqua. Derfor er fremstilling av akseniske larver spesielt viktig for å studere samspillet mellom spesifikke bakteriestammer og insekter16. For tiden er en vanlig metode for å eliminere insekttarmbakterier bruk av en antibiotikakombinasjon for å utrydde tilknyttede mikrober 17,18,19. I motsetning til bruk av antibiotika alene, som bare kan redusere mikrobielle tall, tillater aksenisk oppdrett av insekter kontroll over sammensetningen og mengden av mikroorganismer, noe som muliggjør mer nøyaktig validering av tarmmikrobiota-funksjonalitet.
Dermed introduserer denne artikkelen en protokoll for å forberede og oppdrette aksenisk D. antiqua. Axenisk larvemat oppnås ved å benytte høytemperatursterilisering av naturlige dietter kombinert med halvfermenterte matvarer. Eggene steriliseres etter en eksperimentell protokoll for å oppnå akseniske egg, og til slutt dyrkes akseniske larver fra akseniske egg. Det akseniske oppdrettssystemet ble utført i bare en generasjon for forsøket. Dette vil gi bekvemmelighet for å studere samspillet mellom insekter og tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua er hentet fra feltet Fanzhen, Taian.
1. Forberedelse av sterile dietter
- Fjern de ytre lagene av vårløk og kast de grønne bladene. Hold den hvite delen av vårløkene (figur 1A) og vask dem med sterilt vann, gjenta skylleprosessen tre ganger. Skjær den hvite delen av vårløken i biter på 1-2 cm i terninger ved hjelp av saks (se materialfortegnelse) sterilisert med 75 % EtOH-oppløsning (nevnt i trinn 2.5) for senere bruk.
- Vei 50 g av vårløkene i terninger og legg dem i en foodprosessor (se Materialfortegnelse). Tilsett 50 ml sterilisert vann og slip dem i fem ganger i 2 minutter hver. Alle vårløkene i terninger skal jordes i en pastalignende konsistens (figur 2A).
- Bruk pinsett til å overføre 10 stk 3rd instar larver av D. antiqua til et 10 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml 1x PBS, og slip dem med en engangs slipepestle (se materialfortegnelse) i ca 5 minutter for å oppnå en larval slipevæske.
- Hell den deigaktige vårløkvæsken og larveslipevæsken i en ren 500 ml konisk kolbe (se materialfortegnelse). Pakk den koniske kolbemunningen med to lag gjennomsiktig tetningsfilm, og legg deretter kolben i en ristende inkubator (se materialtabell) for gjæring ved 25 ° C og 180 o / min i 12 timer (figur 2B).
- Klipp ut syv lag firkantet gasbind med 10 cm sider (ikke behov for sterilitet) med saks og stable dem sammen for å danne en enkel filterenhet. Hell langsomt den fermenterte vårløkvæsken på gasbindet og press ut den filtrerte væsken i en ny 500 ml konisk kolbe. Pakk de resterende vårløkrestene på gasbindet i tinnfolie for senere bruk.
- Filtrer filtratet oppnådd i forrige trinn ved hjelp av en vakuumpumpe (se materialfortegnelse) og en Buchner-trakt. Legg filterpapiret fuktet av avionisert vann på Buchner-trakten, og hell deretter filtratet og utfør sugefiltrering i tre ganger med forskjellig filterpapir. Samle det endelige filtratet i den 500 ml koniske kolben.
- Utfør en annen filtrering ved hjelp av en 0,22 μM filterflaske og en vakuumpumpe. Skru dekselet på sugefilterkolben i en ultraren benk (se materialfortegnelse) for videre bruk. På dette tidspunktet oppnås gjæret vårløkrest og filtrat (figur 2C).
MERK: Den filtrerte væsken oppnådd fra dette trinnet vil være steril. (0,22 μM filterflaske er et sterilt vakuumfiltreringssystem for sterilisering av filtratet). - Gjenta de forrige trinnene for å oppnå ugjæret vårløkrester og filtrat. Her er forskjellen at gjæringen ikke er nødvendig.
- Vei 0,24 g kolinklorid og 0,56 g L-askorbinsyre (se materialfortegnelse) i et 10 ml sentrifugerør. Tilsett 3 ml avionisert vann og rist kraftig til de er helt oppløst. Bruk en ny 5 ml sprøyte i den ultrarene benken og fest tre 0,22 μM sprøytefiltre (se materialfortegnelse) for å sterilisere oppløsningen, og legg den i et sterilt 10 ml sentrifugerør for senere bruk.
MERK: Kolinklorid er en essensiell nevrotransmitter for vekst av insekter, mens L-askorbinsyre virker som konserveringsmiddel. - Vei 2 g agarpulver og 6 g TSB (se materialfortegnelse) og hell dem i en 500 ml konisk kolbe. Tilsett deretter 100 ml avionisert vann for å forberede kulturmediet. Etter å ha skyllet glassstangen med avionisert vann, bruk den til å røre blandingen til den er godt blandet. Deretter forsegler du den koniske kolben med to lag gjennomsiktig tetningsfilm.
- Pakk fermentert vårløk og ugjæret vårløk (nevnt i trinn 1.5 og trinn 1.8) i aluminiumsfolie og steriliser dem, sammen med kulturmediet, i en autoklav ved 121 ° C i 20 minutter.
- I den ultrarene benken, hell det steriliserte kolinklorid, L-askorbinsyre og sterilfiltratet inn i kulturmediet mens du forsiktig virvler for å blande dem grundig. Til slutt, tilsett de gjærede og ugjærede vårløkene og rist kraftig for hånd for å oppnå de sterile diettene. Hell diettene i 50 ml sentrifugerør (steril; ventilhette med en 0,22 μM PVDF hydrofob membran) (se materialfortegnelse) i en vinkel (figur 2D).
MERK: Etter sterilisering bør temperaturen på kulturmediet opprettholdes mellom 65-80 °C for å forhindre rask avkjøling og størkning ved tilsetning av vårløk eller andre ingredienser. Foruten, i hvert rør, hell ca 10-15 ml dietter. Når diettene har stivnet, oppbevar tubene i kjøleskap ved 4 °C, hvis det ikke brukes umiddelbart.
2. Oppkjøp av akseniske egg
- Laboratorieoppdrettssystem for D. antiqua
- Plasser et oppdrettsbur i en 25 ° C internt LED-opplyst inkubator (24 timer i syklusen, forholdet mellom lys og mørke er 16: 8) til bakre mannlige og kvinnelige voksne, slik at de kan pare seg og legge egg. Fyll vanndispenseren (figur 1B) med vann og forsegl den med fuktet bomullsull for å gi vann til de voksne.
- Plasser fire 35 mm x 12 mm petriskålbunner i et 94 mm x 16 mm petriskaklokk. Våt bomullsull med ionisert vann og legg deretter fuktig bomullsull på to av petriskålbunnene, og på toppen av bomullsullen, tilsett en spiseskje sukrose.
- Fyll de to andre petriskålbunnene med to spiseskjeer sukrose og gjærekstrakt (se materialfortegnelse), som tjener som mat for de voksne insektene (figur 1C).
MERK: Sukrose- og gjærekstraktet nevnt i trinn 2.1.2 og trinn 2.1.3 trenger ikke å steriliseres. - Sett en 94 mm x 16 mm petriskålbunn som inneholder fuktet sand og et stykke rotløst, skrellet hvitløksfedd (figur 1D) inne i flueburet for å samle egg. Hunnen vil bli tiltrukket av lukten av hvitløk og legge egg rundt den.
- Innsamling av egg
- Ta ut oviposisjonsanordningen, som er en 94 mm x 16 mm petriskål som inneholder sand og hvitløk nevnt ovenfor (trinn 2.14), fra buret. Hell sanden sammen med hvitløken i et 500 ml begerglass, og bruk vann fra springen til å skylle de resterende eggene fra hvitløken i begeret. På dette tidspunktet flyter eggene i vannet.
- Ta en 100-masket sil (se materialfortegnelse), og fukt den med vann fra springen. Hell deretter vannet som inneholder de flytende eggene fra begeret på sikten. Eggene vil forbli på silen.
- Etter at eggene har tørket naturlig på silen, bruk en børste til å feie eggene forsiktig på en petriskål.
- På den første dagen, skyll oviposisjonsanordningen for å samle eggene uten desinfeksjon eller sterilisering. På den andre dagen klokka fire om ettermiddagen, skyll eggene igjen og samle dem ved å sile dem med rent vann.
MERK: Innsamling av eggene på den andre dagen er å sikre jevn veksthastighet i de påfølgende stadiene. Klokken fire på ettermiddagen er eggleggingstoppen for D. antiqua. Dermed er det ideelt å samle eggene på dette tidspunktet. - Legg de oppsamlede eggene på en steril cellesil (se materialfortegnelse) i den ultrarene benken (figur 3A).
- Forbered løsningen for eggsterilisering
- Ta 5 ml 5,2% NaClO (se materialfortegnelse) og overfør det til en sterilisert 250 ml konisk kolbe. Tilsett 95 ml sterilisert vann for å lage et totalt volum på 100 ml, noe som resulterer i en 0,26 % NaClO-løsning.
- For å tilberede en 75 % EtOH-oppløsning, ta 75 ml 99,7 % EtOH og overfør den til en sterilisert 250 ml konisk kolbe. Tilsett 25 ml sterilisert vann for å lage et totalt volum på 100 ml, noe som resulterer i en 75% EtOH-løsning.
- Hell 30 ml NaClO i en petriskål og hell 30 ml EtOH i en annen petriskål. Legg cellesikten som inneholder egg nevnt i trinn 2.4 i skålen som inneholder NaClO. Bløtlegg den i 0,26 % NaClO-oppløsningen i 0,5 min. Overfør deretter sikten til fatet som inneholder EtOH, slik at den kan suge i 75% EtOH-løsningen i ytterligere 0,5 minutter.
- Gjenta denne prosessen tre ganger, vekslende mellom 0,26 % NaClO og 75 % EtOH hvert 0,5 min. Etter det vil akseniske egg bli oppnådd. På dette tidspunktet skal sikten som inneholder eggene være nedsenket i EtOH.
MERK: For å sikre grundig sterilisering, bruk en 1 ml pipette til å aspirere NaClO og EtOH og spre eggene. Gjenta skylleprosessen flere ganger. Dette trinnet vil ytterligere rense overflaten av eggene fra gjenværende bakterier og urenheter, og sikre en ren og steril overflate.
3. Oppdrett av akseniske larver
- For å overføre de steriliserte eggene, bruk en saks som er sterilisert med en alkohollampe for å kutte endespissen på en 1 ml pipette (figur 3B). Sørg for at endeåpningen av kuttpipetten er større enn eggets diameter (ca. 2 mm). Bruk deretter pipetten til å overføre eggene fra EtOH-løsningen (egg sammen med løsningen) (figur 3C) til et sentrifugerør som inneholder de sterile diettene, og hvert rør skal inneholde ca. 20-50 egg (figur 3D). Gjenta denne prosessen til alle eggene er overført.
MERK: Diameteren på pipettespissen skal være så stor som mulig for å unngå å bryte eggene under overføring, noe som kan føre til deres død. - Bruk en pipette for å fjerne overflødig etanol fra røret. Plasser sentrifugerøret lukket med lokk inne i en selvforseglende pose, og legg et stykke bomull ved åpningen av posen for å tillate luftcirkulasjon. Til slutt plasserer du posen inne i en 25 °C inkubator (relativ fuktighet: 50%-70%; fotoperiode: 16 t lys: 8 timer mørk) for observasjon og dyrking.
- Ca. tre dager senere begynner økseeggene i diettene å klekke (figur 4A). De klekkede larver vil være aktive og overflaten av de sterile diettene vil ikke lenger være glatt. Larvene vil begynne å mate på diettene.
- Fortsett å observere larvene til de når stadiet av 2. Fortsett å overvåke veksten og utviklingen i denne perioden.
- Etter 9-12 dager har mer enn 80% av eggene utviklet seg til 3. stjernelarver (figur 4B). Dette indikerer vellykket vekst og utvikling av larver.
4. Validering av akseniske larver med dyrkningsavhengige analyser
- Velg tilfeldig tre akseniske 3rd instar larver fra sentrifugerøret.
- Legg larvene i en 94 mm x 16 mm petriskål som inneholder 75 % alkohol til rengjøring. Deretter overfører du dem til en beholder med sterilt vann for ytterligere skylling.
- Bruk en desinfisert dissekerende tang som er sterilisert med 75% EtOH-løsning for å ta tak i larvene (hodet og halen er vist i figur 5A). Bruk dissekerende saks for å fjerne hode- og haleendene (figur 5B). Hold halen på larvene med tangen og bruk en annen tang til å klemme forsiktig fra halen til hodet og trekke ut de indre organene (resultatet vist i figur 5C). Plasser de indre organene i avionisert vann og trekk forsiktig av tarmen ved å trykke på fettvevet med tang, og legg det ekstraherte indre (figur 5D) i sterilt vann for videre bruk.
- Plasser tarmen i et sterilt 1,5 ml sentrifugerør, tilsett 500 μL sterilisert 1x PBS-buffer, og bruk en engangspestel for å male tarmvevet til et homogenat.
- Ta 100 μl av homogenatet og tilsett det til et nærings-agarmedium. Bruk en L-formet spreder (se Materialfortegnelse) for å stripe agarplaten.
- Plasser petriskålen i en biokjemisk inkubator ved 28 °C og inkuber i 72 timer for å observere veksten av kolonier.
5. Validering av akseniske larver med kulturuavhengige analyser
- Ekstraher totalt DNA fra tarmvevet til akseniske larver ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et UV-spektrofotometer.
- Utfør PCR-reaksjon ved hjelp av universelle bakterielle 16S rRNA-primere (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Det totale reaksjonsvolumet er 25 μL, og består av 1 μL DNA-mal, 0,5 μL fremoverprimer, 0,5 μL reversprimer, 10,5 μLddH2O og 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (se materialfortegnelse). Still inn PCR-reaksjonsbetingelsene som følger: innledende denaturering ved 94 °C i 3 minutter; 35 sykluser med denaturering ved 94 °C i 30 s, glødning ved 55 °C i 30 s, og forlengelse ved 72 °C i 90 s; endelig forlengelse ved 72 °C i 10 min. Oppbevar PCR-produktene ved 4 °C for videre analyse.
- Utfør PCR-reaksjon ved hjelp av universelle sopp-ITS-primere (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Det totale reaksjonsvolumet er 25 μL, og består av 1 μL DNA-mal, 0,5 μL fremoverprimer, 0,5 μL reversprimer, 10,5 μLddH2O og 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Sett PCR-forholdene på 95 °C i 5 minutter; 35 sykluser á 95 °C i 30 s, 55 °C i 1 minutt og 72 °C i 90 s; etterfulgt av 72 °C i 10 minutter. Oppbevar PCR-produktene ved 4 °C for videre analyse.
- Bruk Super Green nukleinsyrefargestoff (se materialtabell) for å blande med hver av de to typer PCR-produkter jevnt, og analyser dem ved elektroforese på en 1% agarosegel i 1x TAE-buffer (fortynnet fra 50x TAE, se materialtabell). Bruk 3 μL DNA-markør (se materialfortegnelse) som referanse.
- Bruk en UV-transilluminator for å observere gelen og finne målfragmentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Livsstadiene til D. antiqua er avbildet i figur 4. Den komplette livssyklusen består av egg, larver, puppe (figur 4C) og voksne (figur 4D). De dyrkes i sterile sentrifugerør, og deres utseende og overlevelsesrate kan ikke skilles fra D. antiqua oppdratt under ikke-akseniske forhold. Vekst- og utviklingstider for hvert stadium av D. antiqua finnes i figur 6. Eggstadiet av ikke-aksenisk oppdrettet D. antiqua er 2,83 ± 0,29 dager, og det for aksenisk oppdrettet D. antiqua er 2,83 ± 0,29 dager, uten signifikant forskjell mellom de to (Uavhengig t-test, t = 0,00, p = 1,00). Det normale larvestadiet varer i 13,83 ± 0,76 dager, mens det akseniske larvestadiet varer i 14,50 ± 0,50 dager, uten signifikant forskjell mellom de to (Uavhengig t-test, t = 1,27, p = 0,27). Puppestadiet til normalt oppdrettet D. antiqua er 17,33 ± 0,76 dager, og det for aksenisk oppdrettet D. antiqua er 18,00 ± 0,50 dager, uten signifikant forskjell mellom de to (uavhengig t-test, t = 1,27, p = 0,27). Overlevelsestiden for voksne er 81,50 ± 1,00 dager for normal oppdrett og 80,33 ± 0,76 dager for aksenisk oppdrett, uten signifikant forskjell mellom de to (uavhengig t-test, t = 1,61, p = 0,18). Det kan observeres at det ikke er noen signifikant forskjell i utviklingstiden mellom aksenisk D. antiqua og de som er oppdratt under normale forhold.
Dyrkningsavhengige analyser viste at det ikke ble påvist kolonier i larvetarmen (figur 7). Videre avslørte PCR-analyse basert på bakterielt 16S rRNA tilstedeværelsen av et bånd på rundt 1500 bp (figur 8A), identifisert som Wolbachia (GenBank-tiltredelsesnummeret for denne nukleotidsekvensen er: OR564190), en endosymbiotisk bakterie. Imidlertid ble det ikke observert noen bånd i PCR-analysen rettet mot sopp-ITS-regioner (figur 8B). Dette indikerer at larvene har oppnådd aksenisk tilstand. Akseniske larver er av stor betydning for å studere mekanismene for interaksjon mellom D. antiqua og mikroorganismer, samt for å forebygge og kontrollere skaden forårsaket av D. antiqua.
Figur 1: Oppdrettsanordninger og mat for D. antiqua. (A) Den hvite delen av vårløk for larver. (B) Vanndispenser for voksne. (C) Mat til voksne. (D) Oppsamlingsanordning for eggene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Komponenter i diettforberedelse. (A) Markløk. (B) Fermentert vårløk. (C) Fermentert vårløkrester og filtrat. (D) Tilberedte dietter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosessen med eggoverføring. (A) Egg i cellesikten. (B) 1 ml pipette uten endespiss. (C) 1 ml pipette med egg. (D) Egg overført til dietter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Livsstadier av aksenisk D. antiqua. (A) Egg. (B) Larver. (c) Puppe. (D) Kvinnelige og mannlige voksne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prosessen med å dissekere larvetarmene. (A) Larvens hode og hale. (B) Larven med hode og hale fjernet. (C) Separert tarm og kroppsvev. (D) En intakt tarm etter disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Utviklingstid for hvert vekststadium av normalt oppdrettet og aksenisk oppdrettet D. antiqua. Ingen signifikant forskjell i utviklingstid mellom aksenisk oppdrettet og normalt oppdrettet D. antiqua. Uavhengig t-test, p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bekreftelse av steriliteten til D. antiqua ved tilfeldig utvelgelse av tre larver og inkubering av tarmhomogenater på TSA- og PDA-agarplater. Ingen bakterier ble observert hos larver som fikk steril diett. (A) Akseniske larver på TSA. (B) Normale larver på TSA. (C) Akseniske larver på PDA. (D) Normale larver på PDA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Bekreftelse av steriliteten til D. antiqua ved PCR-analyse ved bruk av universelle 16S rRNA-primere og sopp-ITS-primere. Målbåndet til 16S rRNA-genet er ~ 1,500 bp. Et bånd på ca. 1500 bp ble observert og identifisert som den endosymbiotiske bakterien Wolbachia. Målbåndet til ITS-genet er 500-750 bp. Ingen målbånd ble observert i AF-gruppene. (A) 16S rRNA elektroferogramme. (B) ITS elektroferogramme. Forkortelser: M = markør; NC = negativ kontroll; NF = normal fôring; AF = aksenisk fôring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insekter har en svært kompleks tarmmikrobiota20,21, noe som nødvendiggjør bruk av akseniske insekter inokulert med spesifikke tarmmikrobielle stammer for å studere insekt-mikroorganismeinteraksjoner. Utarbeidelsen av akseniske insekter er avgjørende for slike forskningsbestrebelser. Antibiotisk behandling er en metode som brukes til å eliminere tarmmikrobiota. For eksempel matet Jung og Kim22 Spodoptera exigua med penicillin, mens Raymond23 matet P. xylostella med et kunstig diett som inneholdt rifampicin for å fjerne tarmbakteriene. Imidlertid kan antibiotikabehandling ikke helt eliminere tarmbakterier og har mange bivirkninger på vertsinsekter. Disse inkluderer endringer i metabolsk enzymaktivitet, nedsatt tarmfunksjon, hemming av vekst, utvikling og reproduksjon, samt økt dødelighet 23,24,25. Følgelig kan funksjonaliteten til insektets tarmmikrobiota maskeres etter antibiotikabehandling. Heldigvis kan dette problemet overvinnes ved kjemisk desinfisering av eggets overflate, noe som muliggjør produksjon av akseniske insekter med relativ letthet16. Til sammenligning er kombinasjonen av overflatedesinfeksjon av eggene etterfulgt av fôring med sterile dietter mer effektiv og gjennomførbar enn antibiotikabehandling26,27.
Innhenting av aksenisk D. antiqua er primært avhengig av å bruke akseniske egg og sterile dietter. Sammenlignet med andre insektarter er eggene av D. antiqua relativt små. Tidligere brukte desinfeksjonsmetoder, for eksempel kort bløtlegging av eggene i 0,1% natriumdodecylbenzensulfonat etterfulgt av en 5 minutters behandling med en 2% hydrogenperoksidløsning for å oppnå akseniske kakerlakkegg28, eller bruk av en 10% natriumhypoklorittløsning i 10 minutter for å overflatedesinfisere egg av den røde palmesnutebillen29, er ikke egnet for desinfisering av D. antiqua Egg. Tidligere studier på desinfeksjon av egg av Diptera-arter, for eksempel bruk av hydrogenperoksidløsninger som brukes som hånddesinfeksjonsmiddel og hydrogenperoksid som overflatedesinfeksjonsmiddel for å sterilisere Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) egg30, eksisterer. Derfor blir det nødvendig å optimalisere valget av desinfeksjonsmiddel og desinfeksjonstid. Etter eksperimentering har det blitt funnet at bruk av 0,26% NaClO og 75% EtOH, desinfisering av eggene i 0,5 min og gjenta prosessen tre ganger, kan oppnå sterilisering av D. antiqua egg.
Etter å ha fått akseniske egg, er et annet viktig aspekt ved oppdrett av aksenisk D. antiqua å gi dem sterile dietter for larver in vitro. Selv om kunstige dietter ikke fullt ut kan replikere naturlig mat, har studier 31,32,33 vist muligheten for å oppdrette insekter ved hjelp av kunstige dietter. Næringsinnholdet i kunstige dietter kan påvirke immunforsvaret og tilpasningsevnen til insekter34. Derfor er det viktig for kunstig tilberedte dietter å inneholde lignende ernæringsmessige komponenter til naturlig mat. Dette vil bidra til å sikre at oppdrettede insekter får de nødvendige næringsstoffene for deres utvikling, immunrespons og generelle helse. I denne studien tjener vårløk som den primære komponenten i sterile dietter for D. antiqua. Halvfermenterte dietter gir bedre næringsstoffer til D. antiqua, noe som bidrar til vekst og utvikling. I tillegg har blanding av larvehomogenatet med diettene som mål å lette forfordøyelsen av diettene av tarmmikrobiota utenfor kroppen. Dette skyldes at tarmbakterier har effekt på insektfôring og fordøyelse35. Ved hjelp av denne metoden for å forberede sterile dietter for D. antiqua forenkler prosessen og forbedrer effektiviteten av diettpreparatet betydelig.
Bakterielle symbionter overført maternalt i celler er allment tilstede i insekter36. Wolbachia, en intracellulær bakterie overført maternalt, er tilstede i mange insekter37. Wolbachia er mest kjent for sin rolle i reproduktiv manipulasjon, da det kan forstyrre kjønnsforholdet mellom vertens avkom mot å produsere flere infiserte kvinner38. Etter å ha verifisert den akseniske tilstanden til D. antiqua larver, ble det funnet at larvene i hovedsak var akseniske etter desinfeksjon, bortsett fra endosymbiotiske bakterier Wolbachia, tilstede i cytoplasma av eggstokkvevsceller i D. antiqua og overført vertikalt over generasjoner gjennom cytoplasma av eggceller. Når det gjelder metoden for å eliminere Wolbachia, er antibiotikabehandling en vanlig tilnærming. Oppsummert presenterer denne artikkelen en metode for oppdrett av aksenisk D. antiqua. Ifølge protokollen kan aksenisk D. antiqua bli vellykket avlet. Videre er denne metoden preget av sin enkelhet og lave kostnader, noe som gir en ny tilnærming for oppdrett av andre akseniske insekter og øker muligheten for å studere samspillet mellom insekter og tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (32272530), New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2021TZXD002), og Science and Education Integration Project of Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
