Questo protocollo utilizza l'imaging a foglio luminoso per studiare la funzione contrattile cardiaca nelle larve di zebrafish e ottenere informazioni sulla meccanica cardiaca attraverso il monitoraggio cellulare e l'analisi interattiva.
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Articolo metodologico
Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra è un intrigante organismo modello noto per la sua notevole capacità di rigenerazione cardiaca. Studiare la contrazione del cuore in vivo è essenziale per ottenere informazioni sui cambiamenti strutturali e funzionali in risposta alle lesioni. Tuttavia, ottenere immagini 4-dimensionali ad alta risoluzione e ad alta velocità (4D, 3D spaziale + 1D temporale) del cuore del pesce zebra per valutare l'architettura cardiaca e la contrattilità rimane una sfida. In questo contesto, per superare questi limiti tecnici vengono utilizzati un microscopio a foglio luminoso (LSM) interno e un'analisi computazionale personalizzata. Questa strategia, che coinvolge la costruzione del sistema LSM, la sincronizzazione retrospettiva, il tracciamento di singole cellule e l'analisi diretta dall'utente, consente di studiare la microstruttura e la funzione contrattile in tutto il cuore alla risoluzione di una singola cellula nelle larve transgeniche di pesce zebra Tg (myl7:nucGFP). Inoltre, siamo in grado di incorporare ulteriormente la microiniezione di composti di piccole molecole per indurre lesioni cardiache in modo preciso e controllato. Nel complesso, questo quadro consente di tracciare i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, nonché la meccanica regionale a livello di singola cellula durante la morfogenesi e la rigenerazione cardiaca.
Introduzione
Il pesce zebra (Danio rerio) è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio dello sviluppo, della fisiologia e della riparazione cardiaca grazie alla sua trasparenza ottica, alla trattabilità genetica e alla capacità rigenerativa 1,2,3,4. In caso di infarto del miocardio, mentre i cambiamenti strutturali e funzionali hanno un impatto sull'eiezione cardiaca e sull'emodinamica, le limitazioni tecniche continuano a ostacolare la capacità di studiare il processo dinamico durante la rigenerazione cardiaca con l'elevata risolu....
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Protocollo
L'approvazione per questo studio è stata concessa dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas a Dallas, con il numero di protocollo #20-07. Per il presente studio sono state utilizzate larvetransgeniche di pesce zebra Tg(myl7:nucGFP) 12. Tutta l'acquisizione dei dati e la post-elaborazione delle immagini sono state effettuate utilizzando software o piattaforme open-source con licenze di ricerca o didattiche. Le risorse sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.
1. Allevamento del pesce zebra e microiniezione di embrioni
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Risultati
L'attuale protocollo consiste in tre fasi principali: preparazione e microiniezione del pesce zebra, imaging con foglio luminoso e ricostruzione di immagini 4D, tracciamento cellulare e interazione VR. Ai pesci zebra adulti è stato permesso di accoppiarsi, le uova fecondate sono state raccolte ed eseguite microiniezioni secondo necessità per gli esperimenti proposti (Figura 1). Questo passaggio fornisce un punto di ingresso per esplorare le applicazioni del pesce zebra nello studio dello svi.......
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Discussione
L'integrazione del modello di zebrafish con metodi ingegneristici ha un immenso potenziale per l'esplorazione in vivo dell'infarto miocardico, delle aritmie e dei difetti cardiaci congeniti. Sfruttando la sua trasparenza ottica, la capacità rigenerativa e le somiglianze genetiche e fisiologiche con gli esseri umani, gli embrioni e le larve di zebrafish sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca 1,2,4. La risoluzione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Esprimiamo la nostra gratitudine alla dottoressa Caroline Burns del Boston Children's Hospital per aver generosamente condiviso il pesce zebra transgenico. Ringraziamo la signora Elizabeth Ibanez per il suo aiuto nell'allevare il pesce zebra all'UT Dallas. Apprezziamo anche tutti i commenti costruttivi forniti dai membri dell'incubatore D presso UT Dallas. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH R00HL148493 (Y.D.), dal R01HL162635 (Y.D.) e dal programma STAR DELL'UT Dallas (y.d.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) pesce zebra transgenico | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software e algoritmi | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| Affettatrice 3D | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Sistema di fogli luminosi | |||
| Lente cilindrica | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| Obiettivo di illuminazione 4X | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Obiettivo di rilevamento | Olympus | 1-U2M585 | |
| fotocamera sCMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stadio XYZ motorizzato | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Stadio di inclinazione a due assi | Thorlabs | GN2/M | |
| Motore passo-passo di rotazione | Pololu | 1474 | |
| Perline fluorescenti | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microiniettore e pompa a vuoto | |||
| Microiniettore | WPI | PV850 | |
| Pompa a vuoto | Welch | 2522B-01 | |
| Pipette in vetro pre-estratte | WPI | TIP10LT | |
| Punta capillare per il caricamento del gel | Bio-Rad | 2239912 | |
| Hardware per realtà virtuale | |||
| VR Cuffie | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L Soluzione PTU | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 soluzione di lavoro | - | ||
| 1% agarosio< / forte> | - | ||
| Thermo Fisher | agarosio a basso punto di fusione | Acqua | |
| deionizzata | - | ||
| 10 g / L Soluzione madre di tricaina< / forte> | |||
| Tricaina | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Acqua deionizzata | - | ||
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Soluzione di lavoro per tricaina | |||
| 10g/L Soluzione madre di tricaina | - | - | |
| Deionizzata acqua | - | - | |
| 60X E3 soluzione madre | |||
| Cloruro di sodio | Lab Animal Resource Center (LARC), Università del Texas a Dallas | Cloruro | |
| potassio-KCL | |||
| Cloruro di calcio diidrato-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| Solfato di magnesio eptaidrato-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| RO Acqua | - | - | |
| 1X Soluzione di lavoro E3 | |||
| 60X Soluzione stock E3 | Lab Animal Resource Center (LARC), Università del Texas a Dallas | - | |
| Acqua RO | - | ||
| 1% blu di metilene (opzionale) | - | C16H18ClN3S |
Riferimenti
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, ....
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Ristampe e permessi
