Summary
Detta protokoll använder light-sheet-avbildning för att undersöka hjärtats kontraktila funktion hos zebrafisklarver och få insikter i hjärtmekanik genom cellspårning och interaktiv analys.
Abstract
Zebrafisk är en spännande modellorganism som är känd för sin anmärkningsvärda hjärtregenereringsförmåga. Att studera det sammandragande hjärtat in vivo är viktigt för att få insikter om strukturella och funktionella förändringar som svar på skador. Det är dock fortfarande en utmaning att få högupplösta och snabba 4-dimensionella bilder (4D, 3D spatial + 1D temporal) av zebrafiskens hjärta för att bedöma hjärtats arkitektur och kontraktilitet. I detta sammanhang används ett internt light-sheet-mikroskop (LSM) och skräddarsydd beräkningsanalys för att övervinna dessa tekniska begränsningar. Denna strategi, som involverar LSM-systemkonstruktion, retrospektiv synkronisering, encellsspårning och användarriktad analys, gör det möjligt att undersöka mikrostrukturen och kontraktilfunktionen över hela hjärtat med encellsupplösning i de transgena Tg(myl7:nucGFP) zebrafisklarverna. Dessutom kan vi ytterligare införliva mikroinjektion av småmolekylära föreningar för att inducera hjärtskada på ett exakt och kontrollerat sätt. Sammantaget gör detta ramverk det möjligt att spåra fysiologiska och patofysiologiska förändringar, såväl som den regionala mekaniken på encellsnivå under hjärtats morfogenes och regenerering.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) är en mycket använd modellorganism för att studera hjärtats utveckling, fysiologi och reparation på grund av dess optiska transparens, genetiska traktabilitet och regenerativa kapacitet 1,2,3,4. Vid hjärtinfarkt, medan strukturella och funktionella förändringar påverkar hjärtutstötningen och hemodynamiken, fortsätter tekniska begränsningar att hindra möjligheten att undersöka den dynamiska processen under hjärtregenerering med den höga spatiotemporala upplösningen. Till exempel har konventionella avbildningsmetoder, såsom konfokalmikroskopi, begränsningar när det gäller avbildningsdjup, tidsupplösning eller fototoxicitet för att fånga de dynamiska förändringarna och bedöma hjärtats kontraktila funktion under flera hjärtcykler5.
Light-sheet-mikroskopi representerar en toppmodern avbildningsmetod som framgångsrikt tar itu med dessa problem genom att snabbt svepa lasern över hjärtats kammare och förmak, vilket ger detaljerade bilder med förbättrad spatiotemporal upplösning och försumbara fotobleknings- och fototoxiska effekter 6,7,8,9,10,11.
Detta protokoll introducerar en omfattande avbildningsstrategi som inkluderar LSM-systemkonstruktion, 4D-bildrekonstruktion, 3D-cellspårning och interaktiv analys för att fånga och analysera dynamiken hos kardiomyocyter över hela hjärtat under flera hjärtcykler12. Det skräddarsydda avbildningssystemet och beräkningsmetodiken gör det möjligt att spåra myokardiell mikrostruktur och kontraktil funktion på encellsnivå i transgena Tg(myl7:nucGFP) zebrafisklarver. Dessutom levererades småmolekylära föreningar in i embryona med hjälp av mikroinjektion för att bedöma läkemedelsinducerad hjärtskada och efterföljande regenerering. Denna holistiska strategi ger en ingångspunkt för att in vivo undersöka strukturella, funktionella och mekaniska egenskaper hos myokardium på encellsnivå under hjärtats utveckling och regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande för denna studie beviljades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Texas i Dallas, enligt protokollnummer #20-07. Tg(myl7:nucGFP) transgena zebrafisklarver12 användes för den aktuella studien. All datainsamling och efterbehandling av bilder utfördes med hjälp av programvara med öppen källkod eller plattformar med forsknings- eller utbildningslicenser. Resurserna är tillgängliga från författarna på rimlig begäran.
1. Uppfödning av zebrafiskar och mikroinjektion av embryon
Tidpunkt: 2 dagar
- Underhåll och föda upp vuxna zebrafiskar genom standardskötsel och avelsprocedurer. För detaljerade metoder, se föregående rapport13.
- Utför mikroinjektion enligt fastställt protokoll14. I den aktuella studien utfördes mikroinjektion i 1-2-cellsstadiet (zygot).
OBS: Det är viktigt att noggrant identifiera detta steg för effektiv mikroinjektion och för att säkerställa konsekvent utveckling. Under encellsstadiet bildas en liten kupol ovanpå äggulan, och detta steg varar vanligtvis cirka 12 minuter. När man går vidare till tvåcellsstadiet blir två intilliggande kupoler synliga, och detta stadium varar i cirka 45 minuter efter befruktning15. Mer detaljerad information om systemkonstruktion finns i andra rapporter eller protokoll 12,16,17.
2. Beredning och montering av zebrafiskembryon/larver
Tidpunkt: 7 dagar
- Överför embryon 1 dag efter befruktning (dpf) till E3-vatten med 0,2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU) (se materialtabell) för att förhindra pigmentbildning.
- Byt ut mediet mot färskt E3-vatten med PTU varje dag fram till LSM-avbildning.
- Avbilda embryon eller larver med stereomikroskopet för att registrera deras utveckling vid önskade tidpunkter mellan 0 och 7 dpf.
- Förbered segmenterade fluorerade etylenpropenrör (FEP) med 2 mm innerdiameter för inbäddning av zebrafisklarver under LSM-systemet12.
OBS: FEP-röret används för att säkra sample med brytningsindexmatchande material som liknar det omgivande mediet, såsom vatten. - Från och med 3 dpf, överför fisken till en 150 mg/L tricaine (MS-222) lösning (se Materialtabell) för att immobilisera fisken före avbildning.
- Bered 0,8 % lågsmältande agaros med 150 mg/l tricaine och använd en överföringspipett för att flytta den sövda fisken till agarosen när den har svalnat till rumstemperatur18.
- Använd en annan överföringspipett för att montera fisken med agaros i FEP-rör (Figur 1).
OBS: För att säkerställa den minimala stressen hos de växande embryona utfördes undersökningar före och efter fixering av hjärtaktivitet, såsom hjärtfrekvens, under mikroskopisk observation. Dessa bedömningar syftade till att identifiera eventuella signifikanta skillnader före och efter tricainanestesi. En ytterligare undersökning av hud och muskulatur för oregelbundenheter i hjärtstrukturen, såsom ödem, kan också utföras efter fixering. Koncentrationen av tricaine spelar också en avgörande roll vid hjärtavbildning19, och därför användes tricainelösningen med 150 mg/L koncentration för avbildning av kontraktion hos zebrafisklarver i detta projekt. Medan den nuvarande retrospektiva synkroniseringen gör det möjligt för oss att ta itu med de oregelbundna hjärtslagen20, är en omfattande lösning för 4D-avbildning av hjärtarytmier och långtidsavbildning i zebrafiskar fortfarande under utveckling.
3. Inställning och konfiguration av bildsystem för ljusark
Tidsåtgång: 3-14 dagar
- Konstruera ett internt LSM-system baserat på en cylindrisk lins med hjälp av kontinuerliga vågdiodpumpade fastledarlasersystem (DPSS) vid specifika våglängder såsom 473 nm och 532 nm som belysningskällor (figur 2A).
- Anpassa LabVIEW (se materialförteckning) kontrollkoder för synkronisering av translationellt provsteg, belysning av ljusark och exponering av sCMOS-kamera för att fånga bildsekvenser.
OBS: Mer detaljerad information om systemkonstruktion finns i andra rapporter eller protokoll 12,16,17. Vi uppmuntrar forskargrupper att söka samarbetsmöjligheter med laboratorier som besitter etablerad expertis inom optisk avbildning under systemkonstruktion.
4. Förberedelse av avbildning av zebrafiskar och datainsamling
Tidpunkt: 1 dag
- Kalibrera LSM-systemets rumsliga upplösning och minimera opacitetsvariationer på varierande djup genom att mäta fluorescenspärlor.
- Späd först fluorescerande pärlor (se materialtabell) med en diameter på 0,53 μm till en koncentration av 1:1,5 x 105 med 0,8 % lågsmältande agaros och överför lösningen till det segmenterade FEP-röret.
- För det andra, använd LSM-systemet för att avbilda pärlorna och mät punktspridningsfunktionen (PSF) över hela provet, validera den rumsliga upplösningen och systeminriktningen12.
OBS: I detta system indikerar analysen av representativa resultat för hela bredden vid halva maximum (FWHM) laterala och axiella upplösningar på 1.26 ± 0.15 respektive 2.48 ± 0.15 μm (n = 60 pärlor). Detta tyder på en konsekvent rumslig upplösning genom hela bilddjupet.
- Fäst FEP-röret med monterad zebrafisklarv säkert på den 6-axliga (x, y, z, pitch, yaw och roll) motoriserade sample stage, och sänk ner rören i sample kammaren fylld med E3-vatten. För att undvika att ljuset sprids av gulesäcken och för att bättre lokalisera hjärtats position, rotera zebrafisklarven för att ta bilden från den ventrala sidan (Figur 2B). I det här fallet skulle de flesta tagna bilder innehålla både ventrikel och förmak (figur 2C).
OBS: Med tanke på att de nuvarande avbildningsprocedurerna vanligtvis varade mindre än en timme per fisk och utfördes i en kontrollerad rumstemperaturmiljö, anses kammarens temperaturkontroll och syrenivåreglering vara valfria för detta projekt. För längre tidsintervallstudier, särskilt sådana som är inriktade på utvecklingsprocesser, föreslås dock kontinuerlig temperaturövervakning och reglering vid 27 °C i provkammaren för att säkerställa zebrafiskens fysiologiska miljö och för att förhindra eventuella utvecklingsavvikelser. - Anslut det motoriserade sample stage till arbetsstationen och konfigurera alla nödvändiga parametrar, inklusive önskat rörelseläge.
- Upprätta en anslutning mellan sCMOS-kameran och arbetsstationen. Justera alla viktiga inställningar, till exempel en exponeringstid på 5 ms och önskat intresseområde.
- Konfigurera antalet bildsekvenser och bildrutor i det anpassade LabVIEW-kontrollprogrammet.
- Slå på lasern och initiera LSM-avbildning av sample. Fortsätt processen tills alla bildsekvenser har spelats in.
- Spela in 300 bilder som en 2D-bildsekvens för att täcka 3-5 hjärtcykler hos larven med en bildhastighet på 200 bilder/sekund. Inspelningen fångar hjärtats kontraktilitet på det selektiva planet som belyses av ljusarket.
- Flytta larven med en stegstorlek på 1 μm över belysningen av ljusarket för att praktiskt taget skära provet.
OBS: Stegstorleken för sample stage bör ställas in baserat på den axiella upplösningen för light-sheet-systemet, enligt Nyquist-Shannon samplingssats12. - Upprepa steg 7 för att spela in en ny bildsekvens av det nya provsegmentet tills hela hjärtat är täckt. I allmänhet säkerställer 100-200 bildsekvenser med stegstorleken 1 μm täckningen av hela hjärtat hos en zebrafisklarv (Figur 2D).
OBS: Steg 4.7-4.9 styrs av LabVIEW-programmet och utförs automatiskt av LSM-systemet (Figur 3). Med tanke på den stora mängden bilddata som genereras rekommenderas en standardiserad namngivningskonvention för bildsekvenser. Du kan till exempel ange mappar med namn som "z-1", "z-2" osv. för att kategorisera data i olika bildsekvenser. Inom varje sekvens ska bilderna namnges sekventiellt (t.ex. "1", "2", ...) för att beteckna distinkta tidpunkter. Den totala tiden för att montera fisk, justera avbildningsvinkeln och samla in alla data för en zebrafisklarv är cirka 1 timme.
5. 4D-bildrekonstruktion med parallell beräkning
Tidpunkt: 1 dag
OBS: 4D-rekonstruktionsalgoritmen som utvecklats av vår grupp och exempeldata är offentligt tillgängliga21. Denna metod gör det möjligt att rekonstruera 4D-hjärtbilden från de bildsekvenser som samlats in i föregående steg (tabell 1).
- Öppna filen test_Parallel.m i MATLAB (se Materialförteckning). Ange mappplatsen där råbildssekvenserna lagras i variabeln "baseDir".
- Tilldela variabeln "numOfSlice" med det totala antalet bildsekvenser (vanligtvis 100–150) och variabeln "numOfImage" med antalet bilder (vanligtvis 300–500) i varje sekvens.
- Inspektera bildsekvensen som visar zebrafiskens hjärtas mittplan (till exempel den 51:a sekvensen av totalt 101 sekvenser). Identifiera bildrutenumren för den första och fjärde systolerna i den här sekvensen och tilldela dem till variablerna systolicPoint_1st och systolicPoint_4th.
- Klicka på Kör för att starta processen.
OBS: Längden på hjärtcykeln i varje bildsekvens kommer först att identifieras av MATLAB-programmet genom en jämförelse av likheten (summan av kvadratiska skillnader) mellan bilder vid olika tidpunkter. Därefter kommer hjärtcykeln att uppskattas med hjälp av medelvärdet av cykellängderna från alla bildsekvenser. Därefter kommer startpunkterna för bildsekvenser på olika axiella platser att justeras av programmet genom en iterativ jämförelse av bildlikheten från den första bildsekvensen till den sista bildsekvensen. - Kontrollera resultatet i utdatamappen. Programmet sparar bilderna som ".tif"-filer med tidsstämplar. Varje ".tif"-fil är en 3D-hjärtbild vid en viss tidpunkt. Tidsintervallet mellan två 3D-bilder är lika med den exponeringstid som är inställd.
OBS: Rekonstruera de insamlade bilderna från föregående steg för att skildra 4D (3D spatial + 1D temporal) hjärtsammandragningar. För att förbättra kunskaperna i undersökningar med högt dataflöde under den retrospektiva synkroniseringen möjliggör den här metoden samtidiga beräkningsåtgärder på en GPU genom att utnyttja flera CPU-kärnor via MATLAB-verktygslådan för parallell databehandling och omvandla bilder till gpuArray-formatet.
6. 3D cellsegmentering och cellspårning
Tidpunkt: 1 dag
- Ladda ner 3DeeCellTracker-paketet (se Materialförteckning) och konfigurera Python-miljön22.
- Ladda ner ITK-SNAP annoteringsprogram23 (se Materialförteckning) och använd den för att manuellt märka 3D-hjärtbilden i två utvalda tidpunkter, en vid ventrikeldiastole och den andra vid ventrikulär systole, för att skapa tränings- och valideringsdatauppsättningar.
OBS: Annan märkningsprogramvara kan också vara tillämplig. - I Python kör du träningsprogrammet 3DeeCellTracker och initierar parametrarna noise_level (100 i det här fallet), folder_path och modell i funktionen TrainingUNet3D för att ställa in den fördefinierade 3D U-Net-modellen.
- I MATLAB använder du imageDimConverter.m programmet för att konvertera och byta namn på tränings- och valideringsdatauppsättningen till rätt format för inläsning.
- I Python läser du in datauppsättningarna för träning och validering med hjälp av funktionerna trainer.load_dataset() och trainer.draw_dataset().
- I Python kör du den första delen av spårningsprogrammet 3DeeCellTracker och initierar parametrarna.
Detta inkluderar att definiera bildparametrar för att karakterisera bilddimensioner, segmenteringsparametrar för att välja den maskininlärningsmodell som används för cellsegmentering och spårningsparametrar för att välja de förtränade djupa neurala nätverksmodeller som används för cellregistrering. För första gången rekommenderas användning av U-Net-modellen för cellsegmentering och FFN+ PR-GLS för cellregistrering. Det behövs för att lagra data, modell och resultat i mappar som skapas automatiskt i det här steget. - I MATLAB, använd programmet imageDimConverter.m för att konvertera och byta namn på alla 3D-hjärtbilder till rätt format och överföra dem till datamappen som skapades i det sista steget.
- I Python kör du den andra delen av 3DeeCellTracker-programmet för att starta segmenteringen.
- När den första 3D-bilden har segmenterats jämför du segmenteringsresultatet med den råa bilden och utför manuell korrigering om någon felaktig segmentering hittas. Flytta den korrigerade segmenteringen till den skapade mappen "/manual_vol1".
- I Python kör du den tredje delen av 3DeeCellTracker-programmet för att segmentera alla bilder.
- Använd Amira (se Materialförteckning) för att utföra en visuell bedömning av spårningsresultat genom att jämföra positionerna för spårade celler med motsvarande råbilder. Om testresultaten inte är tillfredsställande, återuppta proceduren från steg 6.6, använd en alternativ maskininlärningsmodell för segmentering eller cellregistrering och starta sedan spårningsprocessen igen.
OBS: Efter segmenteringen lagras data för celletiketter som en 8-bitars bild (0 till 255) som standard, vilket innebär att endast 256 skalor tillhandahålls som etiketter för cellklassificering. Det finns två lösningar för att lösa det här problemet när ytterligare klasser behövs. En lösning är att ställa in dataformatet för celletiketter som en 16-bitars bild i spårningsprogrammet, vilket kommer att orsaka en exponentiell ökning av bearbetningstiden, mer än två dagar i det aktuella fallet. Den andra lösningen är att använda programmet "separateTrackingResults.py" för att efterbehandla celletiketterna, som separerar celler med samma etiketter baserat på deras fysiska plats och tilldelar varje cell en annan etikett. Denna process tar cirka 10 minuter i det här fallet.
7. Analys av hjärtats kontraktilitet i virtual reality-läge
Tidpunkt: 1 dag
- Hämta cellspårningsresultatet från föregående steg.
- Validera data manuellt och välj celler med konsekvent bildintensitet för alla volymer (cirka 500 celler av cirka 600).
- Använd cellLabelsToObj.ipynb script21 för att generera ett ytnät för varje enskild cell via 3D Slicer-programvara24 (se Materialförteckning) och tilldela en unik färgkod till varje cell.
- Exportera varje 3D-modell, som består av alla celler i en enda tidpunkt, som en enda .obj fil som består av flera underobjekt åtföljda av en .mtl-fil för att beskriva celletiketten.
- Importera modellerna till Unity med hjälp av utbildningslicensen, en utvecklingsmotor som används för utökad verklighet.
- Tillämpa de anpassade skripten som består av funktioner skrivna i C# på modellerna och användargränssnittselementen för att möjliggöra 4D-visualisering och interaktiv analys. Utför VR-interaktion enligt steg 7.7.
- Interagera med modellerna i virtuell verklighet (VR) med hjälp av följande funktioner (figur 4):
- Cellmarkering: Markera upp till två celler i taget och visa deras banor, hastigheter, volymer, ytområden och relativa avstånd.
- Val av tidpunkt: Välj en specifik tidpunkt i data för att analysera utdata från de markerade cellerna, till exempel vid t = 0 ms under diastole eller vid t = 200 ms under systole.
- Tidspaus: Frys den dynamiska modellen för att fokusera på de markerade cellerna och deras utdata.
- Kontrast: Modulera kontrasten mellan de markerade cellerna och omgivande celler i modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det nuvarande protokollet består av tre huvudsteg: beredning och mikroinjektion av zebrafiskar, avbildning av ljusark och rekonstruktion av 4D-bilder samt cellspårning och VR-interaktion. Vuxna zebrafiskar tilläts para sig, de befruktade äggen samlades in och utförde mikroinjektioner efter behov för de föreslagna experimenten (Figur 1). Detta steg ger en ingångspunkt för att utforska zebrafiskapplikationer vid undersökning av hjärtutveckling och regenerering, och det spelar också en avgörande roll i den efterföljande avbildningen och analysen. Det sammandragande hjärtat avbildades i olika stadier (från 3 dpf till 7 dpf) med hjälp av det specialbyggda LSM-systemet och justerade bildsekvenserna längs z-axeln för att rekonstruera 4D-zebrafiskhjärtmodellen (figur 2 och figur 3). Dessa modeller utgör en grund för djupa fenotypiska karakteriseringar och är avgörande för att avslöja dynamiken i hjärtats morfologi och funktion över utvecklingstidslinjer. De enskilda cellerna i zebrafiskens hjärta följdes och deras rörelse och interaktion kvantifierades med hjälp av den skräddarsydda VR-plattformen. Hastighets- och relativa avståndsförändringar hos utvalda celler jämfördes också under en hjärtcykel i förmak och kammare för att bedöma regional kontraktilitet och undersöka lokal belastning (Figur 4). Den regionala stammen bestämdes baserat på variationen i förskjutning mellan två intilliggande myokardceller i det aktuella området. Den fraktionerade förkortningen (FS) och ejektionsfraktionen (EF) uppskattades med hjälp av metoder som beskrivs i den publicerade litteraturen25. Ekvationerna för FS och EF är följande:
där Dd och Ds är ventrikeldiametrarna (kort axel, mätt som avstånd mellan olika ventrikelceller) i det slutdiastoliska respektive slutsystoliska stadiet, och Vd och Vs är ventrikelvolymerna (beräknade som ventrikelns långa och korta axeldiametrar) i det slutdiastoliska respektive det slutsystoliska stadiet.
Sammantaget visar dessa resultat en ny strategi som integrerar både fysiologi och teknik för att underlätta volymetrisk avbildning och datatolkning i zebrafiskmodeller, vilket är mycket lovande för att främja utforskningen av hjärtats morfogenes och mekanik.
Figur 1: Insamling av zebrafiskägg och mikroinjektionsprocess. Processen innebär att man parar vuxna zebrafiskar, samlar in befruktade ägg och utför den valfria mikroinjektionen. Under mikroinjektion laddas den fördragna glaspipetten med önskat material. Befruktade ägg är inriktade i raka rader inom agarosformslitsar och placerade vinkelrätt mot nålen. Mikroinjektionen utförs under konstant mikroskopisk observation av både äggen och nålspetsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Avbildningsprocess för ljusark och rekonstruktion av 4D-bilder. A) Schematisk bild av det interna systemet för avbildning av ljusplåtar. CL: cylindrisk lins. EO: excitationsmål. DO: detektionsmål. TL: rör lins. FL: filtrera. CAM: sCMOS-kamera. (B) Schematisk bild av en zebrafisk monterad i FEP-röret och inbäddad med agaros. (C) Rå 2D-bildsekvens fångad från en zebrafisklarv med 4 dpf. Klockan längst upp till vänster på varje bild visar hjärtfasen från och med slutsystole. (D) Illustration av retrospektiv synkronisering för registrering av 4D-zebrafiskbilder. Bildsekvens indikerar en kontinuerlig inspelning på ett visst djup längs z-axeln. Varje bildruta i bildsekvensen representeras av en röd prick, och start- och slutfaserna från slutdiastole till slutsystole markeras i den gula rutan. (E) 4D-rekonstruerade hjärtmodeller från 2D-bildsekvenserna. DPF: dagar efter befruktning. Denna figur är hämtad från Zhang et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: LabVIEW kontrollpanel. (A) Inställningarna som används i kontrollpanelen omfattar konfigurationen av lasern, kameran, bildbanan och motormönstret. (B) Ett exempel på en rå bild av zebrafiskens hjärta som tagits av LabVIEW-programmet. Skalstapel: 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cellspårning och VR-interaktion hjälper till att avslöja zebrafiskars hjärtkontraktilitet. (A) Spårade celler av Tg(myl7:nucGFP) zebrafiskhjärta vid 3 dpf. (B) VR-plattformen ger användarna en uppslukande visning och interaktiv upplevelse av en 4D-zebrafiskhjärtmodell, vilket gör att man kan visualisera hjärtats funktion över tid genom användardefinierad analys. (C) Efter att ha samlat in mätningar från VR-plattformen jämfördes hastighets- och relativa avståndsförändringar under en hjärtcykel mellan utvalda celler vid 3 dpf och 7 dpf. De två första figurerna visar de genomsnittliga hastighetsförändringarna i fem ventrikulära celler och fem förmaksceller, och de andra illustrerar de relativa avståndsförändringarna mellan tre grupper av celler, dvs två ventrikulära celler, en ventrikelcell och en förmakscell och två förmaksceller. D) Hjärtfunktionsbedömning av zebrafiskhjärtan med 3 dpf och 7 dpf. Totalt 370 celler spårades i zebrafiskhjärtan vid 3 dpf och 580 celler spårades vid 7 dpf. Denna figur är hämtad från Zhang et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| NAMN | ANVÄNDNING | IDENTIFIERARE | |
| Anpassade program och algoritmer | |||
| PSF.m | För att beräkna PSF från FWHM-mätningar resultat av fluorescenspärlor. | MATLAB-programmet | |
| 4D Zebrafish Imaging.vi | För att styra och synkronisera hårdvaran i LSM-systemet. | LabVIEW-programmet | |
| test_Parallel.m. osv. | Att rekonstruera 4D-bilder från 2D-bildsekvenser. | MATLAB-programmet | |
| imageDimConverter.m | Att dölja bilddata till ett angivet format för cellspårning. | MATLAB-programmet | |
| separateTrackingResults.py | Om du vill publicera processcellsspårningsresultat för att avgränsa celler med samma etiketter. | Python-programmet | |
| cellTracking_All.py | För att välja celler med konsekvent bildintensitet för alla volymer. | Python-programmet | |
| cellLabelsToObj.ipynb | För att generera ett ytnät för varje enskild cell via 3D-utsnitt. | Python-programmet | |
| DynamicHeartModel.cs osv. | Att skapa en VR-miljö och interagera med objekt. | C#-programmet | |
| Anpassad hårdvarudesign | |||
| 3D-printad provkammare | Att använda med vattennedsänkningsmål. | SolidWorks-design | |
| 3D-printad provhållare | För att anpassa sig till provsteget och hålla provet. | SolidWorks-design | |
Tabell 1: Tabell med anpassade resurser. Exempelkoderna och data laddas upp till Zenodo21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Integrationen av zebrafiskmodellen med tekniska metoder har en enorm potential för in vivo-utforskning av hjärtinfarkt, arytmier och medfödda hjärtfel. Genom att utnyttja dess optiska transparens, regenerativa kapacitet och genetiska och fysiologiska likheter med människor har zebrafiskembryon och larver blivit flitigt använda i forskning 1,2,4. Den överlägsna spatiotemporala upplösningen, minimala fotoskador och optiska snittningsförmåga hos ljusarksavbildning skiljer den åt för 4D-undersökning av hjärtmorfologi och kontraktil funktion hos zebrafisklarver 12,26,27,28. Detta protokoll introducerar ett omfattande tillvägagångssätt som integrerar light-sheet-avbildning, retrospektiv synkronisering, 3D-cellspårning och en interaktiv virtuell verklighetsplattform (VR) för kvantitativa bedömningar. Det ger en ingångspunkt för att fånga och rekonstruera hjärtkontraktion, spåra och kvantifiera den cellulära dynamiken och bedöma de strukturella, funktionella och mekaniska förändringarna under hjärtats utveckling och regenerering. Denna metod kan också förstärkas av flerkanalig fluorescensavbildning för att spåra olika celltyper och linjer för att undersöka cellulär heterogenitet och intercellulär interaktion. Även om zebrafiskmodellens dikotomi från däggdjurssystem och dess begränsning som en akut modell kräver noggrant övervägande, kan framsteg inom genteknik möjliggöra utveckling av transgena zebrafisklinjer som mer liknar mänskliga sjukdomstillstånd, vilket ökar det translationella värdet av fynd som härrör från zebrafiskstudier29.
Denna retrospektiva synkronisering baserad på antagandet om periodisk hjärtcykel används för att rekonstruera ljusarksbilderna av zebrafiskens sammandragande hjärta. Implementeringen av denna metod i light-sheet imaging gör det möjligt att visualisera och analysera det kontrakterande hjärtat vid över 200 volymer per sekund. För att ta itu med utmaningen med den stora mängden data i den aktuella analysen användes parallella beräkningar med flerkärniga CPU och GPU, vilket resulterade i mer än tiofaldig förbättring av bildrekonstruktionseffektiviteten. Under den retrospektiva synkroniseringen antogs det att kardiomyocyterna återgår till sina baslinjepositioner med varje hjärtslag. Även om detta antagande är relativt säkert med tanke på den låga variabiliteten i hjärtslag som ses hos zebrafisk26 som visas i figur 4C, är det fortfarande en förenkling som kanske inte tar hänsyn till alla biologiska nyanser. Innovationer inom avbildning, såsom kompressionsfluorescens och ljusfältsmikroskopi, skulle kunna mildra effekterna av detta antagande genom att minska skivredundansen.
För att möjliggöra den djupgående analysen i den intrikata 4D-hjärtmodellen utvecklades ett beräkningsramverk som inkluderar både 3DeeCellTracker-baserad cellsegmentering och VR-plattform för användarriktade undersökningar. De inneboende funktionerna i detta ramverk, inklusive den höga effektiviteten och den interaktiva manipulationen, gör det möjligt att kvantifiera den cellulära hastighetsförändringen, undersöka cell-cellinteraktionerna och bedöma den regionala och globala myokardmekaniken såsom fraktionerad förkortning, ejektionsfraktion och regional stam30 (Figur 4). Frånvaron av tidigare bedömningar av zebrafiskars hjärtfunktion vid 7 dpf inom den befintliga litteraturen noteras. Men jämfört med data vid 3 dpf från andra forskare överensstämmer de aktuella resultaten med tidigare indikationer på en minskning av både ejektionsfraktion (EF) och fraktionerad förkortning (FS) under intervallet från 3 dpf till 7 dpf25,31. Dessa analysmetoder har en betydande potential för att belysa hjärtdynamiken hos zebrafiskars hjärtskademodeller 12,25.
Eftersom VR-teknik och mjukvara innehåller unika funktioner som stereoskopiskt seende och automatisk registrering av cellpositioner, möjliggör denna plattform en uppslukande och strömlinjeformad metod för att välja specifika celler och analysera deras bana under hela hjärtcykeln. Användningen av VR ger ett intuitivt sätt att utföra komplexa uppgifter som cellsegmentering och annotering, med större effektivitet och noggrannhet 32,33,34. Det stöder också flera användare att använda unika verktyg när de arbetar tillsammans med stora, komplicerade datamängder34. Även om långvarig användning av VR kan framkalla biverkningar som yrsel, kan detta mildras genom förbättrad ergonomisk design och obundna headset. Dessutom, för att ta itu med den betydande beräkningskraft som krävs för att återge komplexa biologiska strukturer i realtid, kan optimering av programvara för omedelbar bearbetning och utnyttjande av molnbaserade datorlösningar förbättra systemets förmåga att hantera intrikata visualiseringar.
Med hårdvaruenheter och beräkningskraft som fortsätter att utvecklas kan denna strategi utvidgas till att undersöka hjärtarytmier i myokardium på både cell- och vävnadsnivå, vilket i slutändan har potential att avslöja den underliggande mekanismen för hjärtmorfogenes och främja utvecklingen av terapeutiska interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att redovisa.
Acknowledgments
Vi uttrycker vår tacksamhet till Dr. Caroline Burns vid Boston Children's Hospital för att generöst dela med sig av den transgena zebrafisken. Vi tackar Elizabeth Ibanez för hennes hjälp med att föda upp zebrafiskar på UT Dallas. Vi uppskattar också alla konstruktiva kommentarer från D-inkubatorns medlemmar på UT Dallas. Detta arbete stöddes av NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) och UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinjector and vacuum pump | |||
| Microinjector | WPI | PV850 | |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
| Virtual reality hardware | |||
| VR headset | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU solution | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 working solution | - | - | |
| 1% Agarose | - | - | |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| 10g/L Tricaine stock solution | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Deionized water | - | - | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Tricaine working solution | |||
| 10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
| Deionized water | - | - | |
| 60X E3 stock solution | |||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
| Potassium Chloride | - | KCL | |
| Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
| RO Water | - | - | |
| 1X E3 working solution | |||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
| RO Water | - | - | |
| 1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
References
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870 (2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244 (2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15 (2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227 (2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828 (2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801 (2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278 (2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112 (2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T.
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763 (2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187 (2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565 (2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225 (2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291 (2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180 (2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854 (2022).
- Yuan, J., et al.
