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方法文章

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

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DOI：

10.3791/66304

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2024年3月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley, 3Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 4Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University, Wu Tsai Neuroscience Institute, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。

摘要

静脉注射的抗癌治疗药物向脑肿瘤的递送受到血脑屏障的限制。一种能够直接在活体（in vivo）中成像大分子在脑肿瘤内蓄积和分布的方法，将极大提升我们理解并优化临床前模型中药物递送的能力。本方案描述了一种在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中，利用双光子活体显微镜（2P-IVM）实时追踪静脉注射的荧光标记纳米颗粒在活体（in vivo）中动态分布的方法。

本方案包含实验动物麻醉与镇痛、颅窗制备、胶质母细胞瘤细胞植入、头固定杆安装、双光子活体成像（2P-IVM）研究以及术后长期随访护理等多步骤操作的详细描述。我们展示了典型的2P-IVM成像过程及图像分析方法，探讨该技术的优缺点，并讨论其潜在应用。

该方法可轻松修改并适用于体内临床前脑成像领域的不同研究问题。

引言

双光子活体显微镜（2P-IVM）是一种荧光成像技术，可用于观察活体组织1。

20世纪90年代首次开发以来，双光子活体成像（2P-IVM）已被用于 体内 视网膜分析2，肾脏3小肠4耳蜗5心脏6气管7, 在多种临床前模型中的大脑8,9在神经科学领域，双光子体内显微成像技术（2P-IVM）作为一种能够在清醒动物体内对健康大脑进行实时成像的技术，日益受到重视10，以及研究阿尔茨海默病等神经系统疾病11帕金森病12 和胶质母细胞瘤（GBM）13,14,15,16.

双光子体内显微成像技术（2P-IVM）为研究胶质母细胞瘤（GBM）发展过程中肿瘤微环境提供了一种精巧的解决方案。尽管一些先前的研究集中于体外（in vitro）17和离体（ex vivo）模型18，其他研究则采用了原位19和异源性20 体内（in vivo）模型来观察GBM。Madden等人在小鼠模型中对CNS-1大鼠胶质瘤细胞系进行了原位成像13。Ricard等人利用原位移植的GL261-DsRed小鼠模型，在2P-IVM中通过静脉注射荧光染料以增强肿瘤区域的血管信号14。

在此，我们采用双光子体内显微成像技术（2P-IVM）在GBM原位小鼠模型中追踪荧光标记的氧化铁纳米颗粒（NP）在肿瘤部位的递送过程。通过颅窗，该方法使我们能够详细研究纳米颗粒在脑内实时的时空分布。

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方案

本方案中所述的动物实验程序符合实验室动物护理行政小组委员会（APLAC）的要求。

1. 细胞培养

  1. 生物安全柜的准备
    1. 洗手，佩戴手套和实验服。打开生物安全柜，将前窗调节至适当的开口高度。让通风柜运行3-5分钟。用70%乙醇喷洒柜内区域，并用纸巾擦拭干净。
    2. 用70%乙醇喷洒所有试剂，然后用纸巾擦拭。将试剂移入生物安全柜中。切勿将任何物品放置在格栅上。若生物安全柜内发生溢洒，先用纸巾覆盖，再喷洒70%乙醇，然后再次擦拭。
    3. 实验结束后，仔细关闭各物品的盖子，擦拭所有材料，将生物安全柜内的物品取出并放回原位。用70%乙醇喷洒生物安全柜内部并擦拭干净。关闭视窗，关闭生物安全柜电源。
  2. 培养基的制备
    1. 向500 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL 100%胎牛血清（FBS）和5 mL抗生素-抗真菌溶液（100倍浓度）。
    2. 将所有试剂通过无菌的500 mL滤瓶（0.22 µm滤膜）过滤。 
  3. 冻存细胞的解冻
    1. 在超净工作台中，向 T75 培养瓶中加入 20 mL 培养基。在培养瓶上标记细胞名称、日期和传代次数。本研究中使用的是贴壁生长的 C6 胶质瘤细胞。
    2. 在37 °C水浴中快速解冻细胞。不要涡旋振荡细胞。解冻后立即使用细胞。
    3. 使用1 mL移液枪头将解冻的细胞转移至T75培养瓶中。转移过程中需小心避免产生气泡，并防止培养瓶瓶口处残留培养基，以免增加潜在污染风险。
  4. 更换培养基
    1. 解冻后次日更换培养基，以去除残留的胰蛋白酶或二甲基亚砜（DMSO）（步骤1.6）。此后，根据细胞融合度，每周至少更换培养基两次或更频繁。传代后一天必须更换培养基，以清除胰蛋白酶。
    2. 更换培养基时，打开吸液装置，连接吸液玻璃移液管，吸除全部培养基。
    3. 加入20 mL培养基（步骤1.2）。
  5. 细胞传代
    1. 将实验所需物品放入超净台中。
    2. 使用吸液玻璃移液管吸除所有培养基，确保玻璃移液管位于培养瓶中无细胞的一侧。此步骤需将T75培养瓶垂直放置。
    3. 加入约 10 mL 室温（RT）磷酸盐缓冲液（PBS，含 Ca++ 和 Mg++ 无钙）或汉克斯平衡盐溶液（HBSS，Ca++, 和 Mg++ 在无细胞的一侧加入 PBS。将 T75 培养瓶水平放置，细胞面朝下，用 PBS 短暂洗涤细胞。
    4. 立即将锥形瓶垂直放置，吸除PBS/HBSS。重复洗涤和吸除操作3次。
    5. 在细胞面加入 2 mL 胰蛋白酶（重组或动物来源）（T75 培养瓶水平放置，细胞面朝下）。置于标准组织培养孵箱中孵育（37 °C，5% CO₂）2孵育4分钟。2分钟后用5 mL移液管吹打一次。
    6. 孵育共4分钟后，将溶液转移至15 mL锥形管中。向锥形管中加入8 mL培养液（2 mL胰酶消化的细胞 + 8 mL培养基 = 总体积10 mL）。
    7. 使用另一个装有滤器的15 mL离心管，通过25 mL移液管转移细胞，以获得单细胞悬液。
    8. 将1/10体积（1 mL）的溶液（细胞+培养基+Tryp-LE）转移至含有20 mL培养基的T75培养瓶中。或者，进行细胞计数（步骤1.7）。次日更换培养基，使用不含胰蛋白酶的培养基溶液。
  6. 冷冻培养基和细胞
    1. 在4 °C冰箱中解冻100% FBS。不可使用水浴或加热，以免破坏FBS中的蛋白质。
    2. 配制50 mL冻存液：混合45 mL DMEM、5 mL FBS和5 mL DMSO。分装至1–2 mL冻存管中，以避免反复冻融和蛋白损伤。储存于-20 °C或-80 °C冰箱中。
    3. 对于剩余的9 mL溶液（步骤1.5），加入1 mL培养基，使总体积达到10 mL。以300 x g 4 分钟。
    4. 吸除上清液，加入1 mL冻存液（见上文），重悬细胞。将细胞置于冻存盒中，放入-80 °C冰箱。将细胞转移至液氮2 用于长期保存，在1至2天后。
  7. 细胞计数
    1. 对于剩余的9 mL（步骤1.5），加入1 mL培养基，使总体积达到10 mL。以300 x g 4 分钟。
    2. 移除上清液，并用 4 mL HBSS 重悬。取 10 µL 细胞重悬于 80 µL HBSS + 10 µL 0.4% 台盼蓝中，稀释倍数 = 10。
    3. 取17 µL溶液，在血细胞计数板中计数四个4 x 4方格内的细胞数。计算四个4 x 4方格的平均细胞数，再乘以104x 稀释倍数以获得细胞/mL。

2. 手术

注意：建议由两名研究人员共同完成手术操作，其中一人负责细胞制备、混合牙科水泥以及总体协助手术过程，另一人则专注于保持无菌状态。配备第二名操作人员协助手术可显著降低污染发生的风险。遵循最佳外科操作规范有助于减少术后并发症的发生概率。图1A展示了颅窗各组成部分的示意图。

  1. 常规准备
    1. 开始前确认该操作已获得当地动物福利机构指南的批准。
      注：本研究使用了5月龄雌性NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）（n = 5）。
    2. 手术前，对所有手术器械进行高压灭菌，并确保所有必要用品均已备齐。打印麻醉和手术记录表。
    3. 确保动物到达后，在动物饲养室至少适应1周，以减少术后额外的应激反应。
    4. 手术当天，确保所有设备（显微镜、加热垫、灭菌器、钻头、真空装置等）均处于可用状态。确认麻醉机内有足够的异氟烷，必要时补充。对于初次操作者，颅窗手术每只动物可能耗时长达2小时；因此，确保有足够的异氟烷至关重要。
    5. 将玻璃窗和头固定杆置于酒精中，并准备一个盛有生理盐水的容器。这将确保操作流程顺畅，最大限度保持无菌环境，并尽可能缩短每只动物的麻醉时间。
    6. 在工作台的无菌表面上打开所有手术材料。例如，可使用无菌纱布包装的内侧作为无菌区域。采用仅使用器械尖端的技术。当不使用手术器械时，将其尖端放置在无菌表面上，例如无菌纱布包装的内侧。
    7. 进行多只动物手术时，每次手术之间应将所有手术器械放入灭菌器中进行消毒。当手术动物超过5只时，应使用一套新的高压灭菌器械。当钻头变钝时，应及时更换新钻头，以避免组织损伤。
  2. 麻醉与手术准备
    注：麻醉设置在手术和成像过程中完全相同。
    1. 使用异氟烷（诱导浓度3%-5%）在麻醉舱中对小鼠进行麻醉。通过测试足底回缩反射（轻捏后肢足垫）确认麻醉深度足够后，将动物转移至准备操作台。通过鼻罩维持麻醉（1%-2%）。在此期间涂抹眼膏，以防止角膜损伤。手术过程中应定期通过检查足部反射来确认反射消失情况。
    2. 如需对动物进行识别，可使用耳孔钳或剪刀标记耳朵，或使用记号笔标记尾巴。
    3. 使用脱毛膏去除耳朵与眼睛之间颅骨区域的毛发。脱毛膏停留时间应遵循制造商建议（30-60秒），以避免皮肤刺激。涂抹时应逆毛发生长方向，确保脱毛膏接触毛根。避免脱毛膏接触眼睛。使用生理盐水清洁该区域，以去除残留的脱毛膏和毛发。也可使用电动剪毛器替代。
    4. 为避免术中和术后疼痛、感染或肿胀，应给予非甾体抗炎药（NSAIDs）、阿片类药物、抗炎剂和抗生素。术前皮下注射卡洛芬（5-20 mg/kg）、缓释布托啡诺（1 mg/kg SQ）、头孢唑林（20 mg/kg SQ）和地塞米松（0.2 mg/kg SQ）。同时皮下注射约0.3 mL的0.9%生理盐水，以防止脱水。
    5. 随后，从颅骨中心向外围以环形方式交替擦拭聚维酮碘和异丙醇，共三次。
  3. 开颅手术
    1. 将动物转移至手术台，使其俯卧于加热垫（约37 °C）上，以确保手术过程中维持等温条件。啮齿类动物低体温会显著降低存活率，并延长术后恢复时间。
    2. 通过耳杆和门齿杆将头部固定于立体定位仪中。对于耳杆，应找到颧弓并将耳杆插入其后方。建议先用优势手固定对侧耳杆（例如，右利手者用右手固定左侧耳杆），再固定另一侧。必要时通过旋转螺丝调整耳杆和门齿杆的位置。
    3. 必要时重新涂抹眼膏，并用铝箔片覆盖眼睛。这将防止明亮的显微镜光源以及后续用于固化氰基丙烯酸酯胶水的紫外光（步骤2.5）对眼睛造成损伤。
    4. 切口前再次检查足趾夹捏反射；如有需要，相应调整麻醉深度。将动物连接至麻醉监测设备，将传感器置于后肢足垫。监测心率和血氧浓度有助于降低死亡率并改善术后恢复。此外，通过肉眼观察胸部运动获取呼吸频率。
    5. 用手术巾覆盖动物身体，以防止低体温和污染。手术开始前进行最后一次聚维酮碘擦拭。
    6. 戴上手套和洁净实验服。
      注：由于该操作具有侵入性，建议使用无菌手套，以降低术后感染和炎症风险，避免导致动物发病或影响双光子体内显微成像（2P-IVM，第5节）的图像质量。
    7. 提起颅骨上的皮肤，将剪刀置于右眼与右耳之间，沿切口标记向颅骨左侧剪开，形成切口，移除圆形皮肤瓣。
      注：根据脑部感兴趣区域和窗口大小，切口位置和直径可有所变化。切口直径应大于头固定杆的直径，以便为后续安装（步骤2.5）留出空间。如有需要，可轻柔分离切口周围的皮肤以创造更多空间。
    8. 用手术刀片或微型刮匙轻柔刮除颅骨表面的骨膜。在颅缝周围去除骨膜时需格外小心，因为这些区域较为脆弱，易出血。使用生理盐水和真空装置保持手术区域清洁无碎屑。刮除骨膜有助于提高氰基丙烯酸酯胶水和牙科水泥（步骤2.5）的粘附效果。
    9. 确定脑部细胞注射的区域。可参考小鼠脑立体定位坐标图谱。根据脑部坐标，使用与窗口直径相同的活检打孔器、手术笔或高压灭菌铅笔标记颅窗位置。
    10. 用优势手持钻，非优势手握持其他器械（如注射器、镊子）。避免在同一位置长时间钻孔。应以短时脉冲方式使用钻头，防止过热。在间歇期间，向颅骨滴加冷生理盐水，以保持术野清晰并防止过热。通过钻头的触觉反馈判断颅骨是否已完全穿透。
    11. 使用冷生理盐水结合真空装置清洁颅骨表面。打开颅骨后，切勿使用纱布或棉签，因为棉纤维残留物在封闭脑窗时可能引发异物反应。
    12. 钻孔时，确保钻孔轨迹和直径与玻璃盖玻片一致。可通过将玻璃盖玻片置于颅骨表面，确认其能恰好嵌入颅窗内。
    13. 当可轻压颅骨瓣使其下陷时，使用镊子小心将其从手术区域移除（图1B，左图）。若尚无法下压颅骨瓣，则继续在颅窗仍与颅骨相连的区域钻孔，并重新评估。
    14. 若出现轻微出血，可使用止血海绵加轻压，或使用冰生理盐水，以帮助减少失血。
  4. 细胞植入
    1. 按照（步骤1.7）所述方法准备并计数待植入细胞，确保细胞浓度为200,000个细胞/µL。
      注：建议将细胞悬浮于室温下可固化的基质膜中，以提高细胞在脑实质中植入的成功率。
    2. 将细胞置于冰上容器中转移至手术室。使用气密微量注射器。吸取前，将注射器保持在冰上，以避免温度变化。
    3. 吸取1 µL后，将注射器置于立体定位仪内。
      注：可使用自动立体定位坐标装置显示X、Y、Z轴位置，以节省时间。也可根据λ点手动计算坐标。不建议注射超过1.5 µL，以防止注射区域过度充盈，导致植入失败、脑实质外生长或转移。
    4. 在脑部V2MM区域（视觉皮层2，内侧中内侧部分）进行细胞植入，对应坐标约为内侧至外侧（M-L）：-1.2至-1.6 mm，背侧至腹侧（D-V）：-2.6至-3.5 mm。
      1. 为便于双光子成像（步骤4.6），应将细胞植入脑表层区域，以便后续通过颅窗观察肿瘤团块。在前至后（A-P）方向0.8 mm深度处注射0.5 µL（100,000个细胞）。进针时应缓慢、分步进行，注射后等待30秒（图1B，中列）。
      2. 退针时采用相同方式，缓慢退出脑组织。避免在脑室附近注射，因为脑脊液可能促进中枢和周围神经系统转移。
  5. 颅窗封闭
    1. 将头固定杆和玻璃盖玻片从酒精转移至生理盐水中。使用真空吸头或镊子将其移至手术部位。
    2. 将玻璃盖玻片置入颅窗内，并在颅骨与玻璃盖玻片之间滴加少量氰基丙烯酸酯胶水。使用紫外光激活的氰基丙烯酸酯胶水可缩短固化时间，并防止意外移位。若胶水溢出至盖玻片表面，应在完全固化前用棉签或手术刀钝面轻柔刮除。
      警告：紫外光对眼睛和皮肤有害。固化胶水时应避免接触眼睛和皮肤。
    3. 固定玻璃盖玻片后，安装头固定杆。混合双组分牙科水泥，放置头固定杆，并将水泥涂布于周围区域，确保头固定杆与颅骨充分接触。使用注射器尖端、手术刀或钻头小心清除多余水泥。
      注：牙科水泥固化速度很快，建议及时操作。
    4. 封闭颅窗后，检查牙科水泥与皮肤之间的颅骨区域是否仍有暴露。如有暴露，可使用外科胶水闭合皮肤以覆盖颅骨；或使用可吸收缝线进行单针缝合。

3. 术后恢复与肿瘤生长

  1. 恢复
    1. 将动物置于恢复笼内的加热垫上，持续监测直至其完全恢复意识。术后将动物单独饲养，以降低受伤风险。
    2. 提供恢复期饮食，例如市售的含电解质或糖类的水凝胶。或者，提供湿润的标准实验饲料，以确保营养摄入顺畅，避免脱水和低血糖。
  2. 监测
    1. 动物恢复后，每日观察其是否有疼痛、痛苦或感染迹象。必要时给予镇痛药、抗炎药或抗生素。若动物达到实验终点，应实施人道安乐死。在最后一次成像结束后，采用二氧化碳窒息法对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱臼。
      注意：早期安乐死的标准示例包括但不限于显著体重减轻（>20%）、神经系统异常、呼吸困难、手术期间大量出血或明显刻板行为。必要时检查颅窗并用生理盐水或酒精清洁。
    2. 为追踪肿瘤生长情况并规划成像时间点，进行全身生物发光成像（BLI）。具体操作为：以150 mg/kg剂量腹腔注射D-荧光素，注射后5–15分钟进行成像。

4. 纳米颗粒合成

  1. 颗粒制备
    1. 将11.17 mL的Ferumoxytol（共含6 mmol Fe）加入含有50 mL 5 M NaOH、20 mL去离子水（DI water）和20 mL环氧氯丙烷的溶液中。此时可观察到相分离现象。将混合物在室温下轻轻振荡孵育24小时。
    2. 24小时后，溶液变为均一状态。使用截留分子量为12,000–14,000 Da的透析袋在水中透析3天，以去除多余的环氧氯丙烷。
    3. 透析后，将管中剩余溶液转移至玻璃瓶中（总体积约110 mL）。加入30 mL氢氧化铵，于37 °C搅拌混合物18–20 h。
    4. 搅拌后，用纯水重复透析3天。将透析袋中剩余的溶液转移至一个新的玻璃瓶中，总体积约为110 mL。
  2. 异硫氰酸荧光素（FITC）偶联
    1. 取出27.5 mL氨基功能化微粒用于FITC偶联。使用10 kDa超滤离心管浓缩微粒，并用pH 9的Na2CO3NaHCO₃3) 缓冲液，5752 × g 条件下 g 在25 °C下孵育10分钟。
    2. 将4 mL溶液加入滤器中，然后以5752 x g超速离心管子 g 在25 °C下孵育10分钟。弃去滤液，用缓冲液重新填充滤器，按相同方案进行第二轮洗涤。
    3. 弃去滤液，用移液器收集滤膜上的溶液。根据Ferumoxytol的质量浓度估算颗粒的摩尔浓度，假设每个颗粒的直径为5 nm。
    4. 将FITC溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为10 mg/mL。缓慢将1.4 mL DMSO溶解的FITC加入浓缩的氨基化微粒中。FITC与微粒的摩尔比为20:1。随后，将溶液在4 °C避光孵育8小时。
    5. 通过加入过量 NH 终止反应3.2O（NH₄Cl 的最终浓度）3.2O为50 mM），然后在4 °C避光孵育2小时。使用Na洗去多余的FITC2CO3/NaHCO₃3 (pH 9) 缓冲液通过 10 kDa 滤膜，在 5752 × g 条件下离心 g 在25 °C下孵育10分钟。使用盐酸水溶液将溶液的最终pH值调节至7.4。

5. 双光子-体内显微镜（2P-IVM）

注意：在双光子活体显微成像（2P-IVM）实验中，使用配备定制载物台的 Prairie Ultima IV 显微镜（图2 和 补充编码文件1），该载物台可水平和垂直调节颅窗的位置。图像的后期处理与分析采用 Fiji 软件。通过此方式，可调节激光束以 90° 角垂直照射玻璃，从而减少成像伪影并提高图像质量。

  1. 成像实验
    1. 打开钛蓝宝石激光器。打开主系统开关和Prairie View软件。
    2. 按照上述方法（步骤2.2）对动物进行麻醉。每只动物的成像时间最长不超过2小时。尽量缩短成像时间，以降低麻醉相关并发症及发病率或死亡率的风险。
    3. 使用定制载物台将小鼠固定在双光子显微镜下（图1B，右列）。将动物俯卧于专为啮齿类手术设计的加热垫上，并用胶带轻轻固定，注意避免压迫胸腔。在颅窗上滴加一滴水，调节焦距。
    4. 采集心率和血氧饱和度，以监测动物的生命体征参数。将传感器置于后肢足垫，并将监测设备置于双光子成像腔室外。
    5. 动物放置于显微镜载物台后，调整头部位置。使用双目镜和宽场荧光照明，设置红色荧光蛋白（RFP）滤光片，并找到所需的成像视野（图1B，右列）。
    6. 确定样本方向和视野后，将显微镜从宽场模式切换至光扫描显微模式（LSM）。
    7. 确保钛蓝宝石激光器在920 nm处处于锁模状态，且所有快门均已打开。将GaAsP光电倍增管探测器（PMT）电压调至500–600 V。使用两个配备带通滤光片（595/50 nm用于RFP，525/50 nm）的PMT。
    8. 点击实时成像，缓慢调节普克尔斯盒（pockel cell），逐步增加样品处的激光功率，直至可见图像。
    9. 获得清晰图像后，使用软件和电动载物台设定在目标样本区域内图像堆栈的顶部和底部位置。注意步长设置，并考虑Z轴调节的是物镜的成像深度。
    10. 随着成像深度增加，图像会变暗。缓慢提高普克尔斯盒/PMT增益以保持图像亮度。注意避免使用过高功率，以免引起光毒性及组织损伤。
    11. 设置保存路径并开始Z轴扫描序列。系统将自动按照设定的普克尔斯盒/PMT参数移动至起始和终止位置。完成堆栈采集后，使用回放功能检查图像质量。完成必要图像采集后，关闭钛蓝宝石激光器。
    12. 将动物转移至恢复笼中，操作如前所述（步骤3.1）。
    13. 退出Prairie View软件，并确保所有数据均已保存或传输。关闭计算机及所有硬件设备。
  2. 使用FIJI进行后期处理
    注：Fiji是一款专注于生物图像分析的开源软件21。
    1. 根据操作系统下载FIJI软件。解压文件夹内容并运行.exe文件。
    2. 将从双光子成像获得的.env文件拖入对话框。将通道拆分为不同的图像窗口。这将生成两个不同通道的图像，一个包含细胞信号，另一个包含颗粒信号。
    3. 复制其中一幅图像，点击文件 > 新建 > 内部剪贴板以创建另一幅图像。将其中一幅图像重命名为源图像，另一幅重命名为复制图像。
    4. 使用复制图像，点击对话框中的处理 > 增强对比度。点击归一化和确定，然后点击处理 > 平滑。该图像用于生成掩膜，不用于分析。点击对话框中的图像 > 调整 > 阈值。使用合适的滑动标尺和方法进行提取，然后点击应用。
    5. 使用处理 > 二值化 > 腐蚀去除背景中的单个像素，然后点击处理 > 二值化 > 膨胀将像素重新添加回图像。
    6. 点击对话框中的处理 > 图像计算器，选择源图像作为第一幅图像，第二幅图像选择为复制图像。使用AND操作生成两幅图像的交集。对另一通道图像重复相同步骤。
    7. 若需分析血管区域外的信号，打开一幅未经修改的复制图像，并使用自由手选区工具（Freehand ROI tool）删除信号中的血管区域。
    8. 通过进入分析 > 设置测量值设定所需参数。确保勾选面积、积分密度和平均灰度值。
    9. 现在通过分析 > 测量进行分析。测量结果窗口将弹出。将数据复制到电子表格中。
    10. 现在选择图像中无荧光的小区域作为背景。
    11. 点击分析 > 测量对该区域进行测量。将数据复制到电子表格中。
    12. 将结果图像保存为文件 > 另存为 > 分析文件类型，以便后续重新测量或用于发表。

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结果

在此，我们对NSG小鼠胶质母细胞瘤（GBM）模型（n = 5）进行了颅窗手术并移植了C6细胞。颅窗构建所涉及的所有组件之间均实现了适当的密封图1A）将确保窗口在长期成像中的耐久性，并进一步降低动物的发病率。使用适配的载物台 体内 双光子体内成像（2P-IVM）图2），我们能够在麻醉状态下对动物进行长达2小时的成像，且无明显运动伪影。在荷有胶质母细胞瘤（GBM）的小鼠静脉注射纳米颗粒后约10分钟，双光子活体显微成像（2P-IVM）显示肿瘤区域血管呈现绿色荧光信号，符合FITC标记的纳米颗粒定位于血管内的特征。仅有少量绿色荧光信号出现在血管外，提示纳米颗粒开始发生外渗（extravasation）图3A）。可见来自血管外空间的FITC信号增强，这与明显的血管外渗相符。图3B).

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讨论

我们提出了一种用于实时 体内 通过颅窗使用双光子体内显微成像（2P-IVM）追踪纳米颗粒，以评估荧光标记的氧化铁纳米颗粒向肿瘤的递送情况。该手术技术要求操作者具备稳定的手法和高级的实验外科技能。建议在开展活体动物实验前，先利用尸体标本或模拟模型进行练习。作为替代方案，Hoeferlin 等人采用机器人钻孔系统，以减少热损伤，降低手术技术的变异性，并实现手术操作的标准化22.

窗口的尺寸是另一个关键参数。较大的窗口能够实现对肿瘤更大区域的双光子体内显微成像（2P-IVM）。文献中报道的窗口尺寸范围为3–7 mm23。然而，较大的窗口无法适应脑组织的曲率，可能导致局部压力升高24。为克服这一限制，可采用所谓的"玻璃颅骨"替代方案25。与传统的平面玻璃窗口相比，该方法使用与脑曲率相匹配的曲面玻璃，从而在减少皮层局部压力的同时，实现更大尺寸的成像窗口。此类曲面玻璃目前...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢斯坦福大学吴蔡神经科学显微技术服务中心、斯坦福体内成像创新中心（SCi3）——小型动物成像中心、美国国立卫生研究院S10共享仪器基金（S10RR026917-01，项目负责人：Michael Moseley博士）以及斯坦福Porter Drive前临床成像设施为本项目提供的设备与基础设施支持。本研究工作得到了美国国家儿童健康与人类发育研究所基金（项目编号：R01HD103638）的资助。我们感谢斯坦福大学Schnitzer研究组、加州大学圣克鲁兹分校Zuo实验室以及波士顿大学波士顿光子中心神经血管成像实验室在双光子成像和颅窗模型方面提供的富有启发性的学术讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠输注溶液Baxter Corp533-JB1301P

改良杜尔贝科氏必需培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）		Invitrogen11965-092
1 mL 注射器BDLuer-Lok 注射器，货号 309628
10% FBSThermo FisherCytiva SH30910.03HI
10% DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
双光子显微镜Prairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
70% 酒精棉片Medline Industries, LPMDS093810
喷雾瓶装酒精Decon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
铝箔Reynold BrandsReynold Wrap 不粘铝箔
麻醉机Patterson ScientificSAS3
麻醉监测仪 Kent Scientific MouseSTAT Jr. 啮齿类动物脉搏血氧仪
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液），液体Invitrogen15240-096
聚维酮碘棉片Professional Disposables International, IncS41125
5 mm 皮肤活检打孔器 Miltex规格 5
缓释型布托啡诺Zoo PharmBup SR Lab, 1.0 mg/mL可使用通用药物替代。 
C6 大鼠胶质瘤细胞系ATCC（美国组织培养收藏中心）CCL-107
套管BD16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
卡洛芬Pfizer Rimadyl, 50 mg/mL可使用通用药物替代。 
头孢唑啉Sagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/瓶可使用通用药物替代。 
细胞筛，40 µmFisher Scientific87711
棉签，6” Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
牙科水泥Stoelting Co51459牙科水泥套件，透明，双组分
地塞米松Bimeda138RX, 2 mg/mL可使用通用药物替代。 
DietGelClearH2O恢复用 DietGel, 72-06-502
手术巾 Cardinal HealthBio Shield Wrap
钻机Saeyang MicrotechEscort Pro, B08350
钻头 Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005规格 005, US 1/4
FIJI 图像分析软件美国国立卫生研究院https://imagej.net/software/fiji/
镊子Fisher Scientific13-812-41
纱布Fisher HealthCare无菌棉质纱布垫，4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam Ethicon Inc. Surgifoam 可吸收明胶海绵，货号 1972
Germinator Cellpoint Scientific Germinator 500, 编号 11688
玻璃盖玻片，直径 5 mmFisher ScientificMenzel 盖玻片 
非无菌手套Fisher Scientific无粉腈类医用检查手套
无菌手套Medline Industries, LPMDS104070
脱毛膏Church & DwightNair 脱毛乳液 
哈密尔顿注射器Hamilton Company IncGastight #1701, 10 µL
不含钙、镁的 HBSSFisher ScientificPI88284
头固定杆Hongway内径 5 mm 的 O 型圈
加热垫Stoelting Co. Rodent warmer X2
胰岛素注射器Exel International Medical Products 29G x 1/2″
氧化铁纳米颗粒Covis Pharma GmbHFeraheme 费鲁莫特醇注射液，510 mg/17 mL，59338077501
异氟烷Dechra26675-46-7
小鼠Jackson LaboratoriesNSG，品系 005557
显微镜（用于手术）Seiler MedicalSeiler IQ Q-100-220
纳米颗粒定制用异硫氰酸荧光素标记的氧化铁纳米颗粒（费鲁莫特醇）
眼用软膏Major PharmaceuticalsLubrifresh P.M. 夜间眼膏，203964
氧气Linde Gas & Equipment Inc. 高压钢制 K 型气瓶，249CF，2000PSIG，CGA 540
塑料杯Georgia-Pacific Consumer ProductsDixie 分装杯，2 盎司，塑料，透明，每包 2400 个
聚乙烯管Braintree Scientific50-195-5494
电子天平Ohaus CorpCR2200
手术刀Integra Life Sciences Production CorpIntegra Miltex 不锈钢一次性手术刀
剪刀Fisher Scientific13-804-18
密封剂Henkel CorpLoctite 4014
一次性实验服High Tech Conversions17-444-081
立体定位仪Stoelting Co. Stoelting New Standard TM
无菌真空瓶顶过滤系统Fisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma 货号：S2GPU05RE
泡沫塑料箱N/AN/A
外科手套Cardinal Health19-163-108
3M Vetbond 组织粘合剂，一次性使用3M Animal Care Products1469SB
尾静脉导管定制由两根 30 G 套管通过硅胶管连接而成 
TrypLE Express（1倍浓度），无酚红Invitrogen12604-039
紫外手电筒Spring Sunshine TechnologyConsciot

参考文献

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