Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66304

⸱

1 maart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley, 3Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 4Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University, Wu Tsai Neuroscience Institute, Stanford University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Samenvatting

De toediening van intraveneus toegediende kankertherapieën aan hersentumoren wordt beperkt door de bloed-hersenbarrière. Een methode om de accumulatie en distributie van macromoleculen in hersentumoren in vivo direct in beeld te brengen, zou ons vermogen om de afgifte van geneesmiddelen in preklinische modellen te begrijpen en te optimaliseren aanzienlijk verbeteren. Dit protocol beschrijft een methode voor real-time in vivo tracking van intraveneus toegediende fluorescerend gelabelde nanodeeltjes met twee-foton intravitale microscopie (2P-IVM) in een muismodel van glioblastoom (GBM).

Het protocol bevat een beschrijving in meerdere stappen van de procedure, inclusief anesthesie en analgesie van proefdieren, het creëren van een schedelvenster, GBM-celimplantatie, het plaatsen van een hoofdbalk, het uitvoeren van 2P-IVM-onderzoeken en postoperatieve zorg voor vervolgonderzoeken op lange termijn. We tonen representatieve 2P-IVM-beeldvormingssessies en beeldanalyses, onderzoeken de voor- en nadelen van deze technologie en bespreken mogelijke toepassingen.

Deze methode kan eenvoudig worden aangepast en aangepast voor verschillende onderzoeksvragen op het gebied van in vivo preklinische beeldvorming van de hersenen.

Inleiding

Twee-foton intravitale microscopie (2P-IVM) is een fluorescentiebeeldvormingstechniek die de visualisatie van levend weefsel mogelijkmaakt1.

2P-IVM werd voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1990 en is gebruikt voor in vivo analyse van het netvlies2, nier3, dunne darm4, slakkenhuis5, hart6, luchtpijp7 en de hersenen in verschillende preklinische modellen 8,9. Op het gebied van neurowetenschappen heeft 2P-IVM aan belang gewonnen als techniek voor real-time beeldvorming van de gezonde hersenen bij wakkere dieren10, evenals het bestuderen van ziekten van het zenuwstelsel zoals Alzheimer11, Parkinson12 en glioblastoom (GBM)13,14,15,16.

2P-IVM biedt een elegante oplossing voor het bestuderen van de micro-omgeving van de tumor tijdens de ontwikkeling van GBM. Terwijl sommige eerdere studies zich richtten op in vitro17 en ex vivo modellen18, implementeerden andere orthotope19 en xenotrope20 in vivo modellen voor het onderzoeken van GBM. Madden et al. voerden native beeldvorming uit van de CNS-1 glioomcellijn van ratten in een muismodel13. Met behulp van een orthotopisch GL261-DsRed-muizenmodel voerden Ricard et al. een intraveneuze toediening van een fluorofoor uit om de bloedvaten in het tumorgebied te versterken in 2P-IVM14.

Hier passen we 2P-IVM toe voor het volgen van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide nanodeeltjes (NP) in een orthotopisch muismodel van GBM. Met behulp van een craniaal venster stelt deze methode ons in staat om de real-time spatiotemporele verdeling van NP's in de hersenen in detail te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De in dit protocol beschreven dierproefprocedure is in overeenstemming met de eisen van het Administratief Panel Proefdierverzorging (APLAC).

1. Celkweek

  1. Voorbereiding van de kap
    1. Handen wassen, handschoenen en een laboratoriumjas dragen. Schakel de biologische veiligheidskast in en stel de vleugel in op de juiste openingshoogte. Laat de afzuigkap 3-5 minuten ontluchten. Spuit de kap in met 70% ethanol en veeg deze af met tissuepapier.
    2. Spuit alle reagentia in met 70% ethanol en veeg ze af met tissuepapier. Verplaats de reagentia in de kap. Leg geen voorwerpen op de grill. Als er gemorst wordt in de kap, bedek deze dan met doekjes, spuit deze in met 70% ethanol en veeg opnieuw af.
    3. Sluit na het experiment voorzichtig de deksels van elk item, veeg alle materialen af, verwijder alle items uit de kap en breng ze over naar hun oorspronkelijke locatie. Spuit 70% ethanol in de kap en veeg deze af. Sluit de vleugel en schakel de biologische veiligheidskast uit.
  2. Bereiding van een groeimedium
    1. Voeg 50 ml 100% foetaal runderserum (FBS) toe aan 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Voeg 5 ml van de antibioticum-antimycotische oplossing toe (100x).
    2. Haal alle reagentia door een steriele filterfles van 500 ml (filter van 0,22 μm).
  3. Ontdooien van gecryopreserveerde cellen
    1. Voeg in een laminaire stroomkap 20 ml van het groeimedium toe aan een T75-kolf. Label de kolf met de naam van de cellen, de datum en het doorgangsnummer op de kolf. In deze studie werden adherente C6-glioomcellen gebruikt.
    2. Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C. Draai de cellen niet in een draaikolk. Ontdooi en gebruik de cellen onmiddellijk.
    3. Breng de ontdooide cellen over in de T75-kolf met behulp van een pipetpunt van 1 ml. Zorg ervoor dat er tijdens het overdrachtsproces geen luchtbellen ontstaan en vermijd dat er mediumresten in de hals van de kolf achterblijven. Dit kan het risico op mogelijke besmetting vergroten.
  4. Het medium wijzigen
    1. Vervang het medium op de dag na het ontdooien om eventuele resterende trypsine of dimethylsulfoxide (DMSO) te verwijderen (stap 1.6). Vervang daarna het medium minstens twee keer per week of vaker, afhankelijk van het niveau van samenvloeiing van de cellen. Het medium moet een dag na passage worden vervangen om trypsine te elimineren.
    2. Om het medium te veranderen, zet u het aspiratieapparaat aan, bevestigt u de aspiratieglazen pipet en zuigt u al het medium op.
    3. Voeg 20 ml van het groeimedium toe (stap 1.2).
  5. Passeren van de cellen
    1. Laad de kap met de items die nodig zijn in de loop van het experiment.
    2. Gebruik een glazen pipet met aspiratie en zuig alle media weg, waarbij u ervoor zorgt dat de glazen pipet zich aan de niet-celzijde van de kolf bevindt. Plaats voor deze stap de T75-kolf verticaal.
    3. Voeg ~10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur (RT) toe (PBS-, Ca++ - en Mg++ -vrij) of Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS-, Ca++ - en Mg++ -vrij) aan de niet-celzijde. Spoel de cellen kort met PBS door de T75-kolf horizontaal te plaatsen met de celzijde naar beneden.
    4. Plaats de kolf onmiddellijk verticaal en zuig de PBS/HBSS op. Herhaal dit wassen en opzuigen 3 keer.
    5. Voeg 2 ml trypsine (recombinant of dierlijk) toe aan de celzijde (T75-kolf horizontaal, celzijde naar beneden). Incubeer in een standaard weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 4 min. Trituer het eenmaal na 2 minuten met een pipet van 5 ml.
    6. Breng de oplossing na 4 minuten totale incubatie over in een conische buis van 15 ml. Voeg 8 ml van de groeioplossing toe aan de conische buis (2 ml getrypsiniseerde cellen + 8 ml medium = 10 ml in totaal).
    7. Gebruik een andere lege conische buis van 15 ml met een filter en breng de cellen over via een pipet van 25 ml om individuele cellen te bereiken.
    8. Breng 1/10 (1 ml) van de oplossing (cel + media + Tryp-LE) over in een T75-kolf met 20 ml media. U kunt ook de cellen tellen (stap 1.7). Verander de media de volgende dag om een media-oplossing zonder trypsine te hebben.
  6. Bevriezen van het medium en de cellen
    1. Ontdooi 100% FBS in een koelkast van 4 °C. Gebruik geen waterbad of warmte, omdat dit de eiwitten in FBS kan beschadigen.
    2. Om 50 ml vriesmedia te bereiden, mengt u 45 ml DMEM, 5 ml FBS en 5 ml DMSO. Aliquot het in containers van 1-2 ml om intermitterend ontdooien en eiwitschade te voorkomen. Bewaar ze in de vriezer van -20 ° of -80 °C.
    3. Voeg voor de resterende 9 ml oplossing (stap 1.5) 1 ml medium toe om in totaal 10 ml te bereiken. Centrifugeer op 300 x g gedurende 4 min.
    4. Verwijder het supernatans en resuspendeer in 1 ml vriesmedium (zie hierboven). Plaats de cellen in een vriescontainer in een vriezer van -80 °C. Verplaats de cellen na 1 of 2 dagen naar vloeibareN2 voor langdurige opslag.
  7. Het tellen van de cellen
    1. Voeg voor de resterende 9 ml (stap 1.5) 1 ml media toe om in totaal 10 ml te bereiken. Centrifugeer op 300 x g gedurende 4 min.
    2. Verwijder het supernatans en resuspendeer in 4 ml HBSS. Resuspendeer 10 μL cellen in 80 μL HBSS + 10 μL 0,4% Trypan Blue, verdunningsfactor = 10.
    3. Neem 17 μL van de oplossing en tel vier vierkanten van 4 x 4 in een hemocytometer. Het gemiddelde telt voor de vier 4 x 4 vierkanten en vermenigvuldigt met 104x verdunningsfactor om cellen/ml te krijgen.

2. Chirurgie

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de operatie door twee onderzoekers uit te voeren, waarbij één persoon verantwoordelijk is voor het voorbereiden van de cellen, het mengen van het tandheelkundig cement en in het algemeen assisteren bij de procedure, terwijl de tweede persoon zich concentreert op steriel blijven. Het hebben van een tweede manipulator om te helpen bij de chirurgische ingreep vermindert de kans op besmetting aanzienlijk. Het volgen van de beste chirurgische praktijken zou de kans op postoperatieve complicaties verkleinen. Figuur 1A geeft een overzicht van de componenten van het schedelraam.

  1. Algemene voorbereidingen
    1. Bevestig dat de procedure is goedgekeurd door de lokale richtlijnen van de instelling voor dierenwelzijn voordat u begint.
      OPMERKING: Deze studie gebruikte vrouwelijke NSG-muizen van 5 maanden oud (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
    2. Autoclaaf vóór de operatie alle chirurgische instrumenten en zorg ervoor dat alle benodigde benodigdheden beschikbaar zijn. Druk de anesthesie- en operatiegegevens af.
    3. Zorg ervoor dat de dieren bij aankomst ten minste 1 week moeten acclimatiseren in de veehouderijruimte om extra postoperatief leed te verminderen.
    4. Zorg er op de dag van de operatie voor dat alle apparaten (microscoop, verwarmingskussen, sterilisator, boormachine, vacuüm, enz.) klaar zijn voor gebruik. Controleer of het anesthesieapparaat voldoende isofluraan bevat en vul indien nodig bij. Voor nieuwe gebruikers kan de craniale raamprocedure tot 2 uur per dier duren; Daarom is het hebben van voldoende isofluraan cruciaal.
    5. Plaats de glazen ramen en hoofdstaven in alcohol en maak een bak met zoutoplossing klaar. Dit zorgt voor een vlotte workflow zonder grote inbreuken op de steriliteit en houdt de tijd onder narcose voor elk dier zo kort mogelijk.
    6. Open al het chirurgische materiaal op een steriel oppervlak op het werkstation. Hiervoor kan bijvoorbeeld de binnenkant van een steriele gaasverpakking worden gebruikt. Gebruik de techniek met alleen tips. Als u geen chirurgische instrumenten gebruikt, plaats de tips dan op een steriel oppervlak, zoals de binnenkant van de verpakking van steriel gaas.
    7. Plaats bij het uitvoeren van meerdere operaties alle chirurgische instrumenten tussen de operaties door in de sterilisator om ze te desinfecteren. Gebruik bij het uitvoeren van operaties op meer dan 5 dieren een nieuwe set geautoclaveerde instrumenten. Verwissel de boorpunt wanneer deze bot wordt door een nieuwe om weefseltrauma te voorkomen.
  2. Anesthesie en voorbereidingen voor een operatie
    OPMERKING: De anesthesie-opstelling is identiek voor de operatie en voor beeldvorming.
    1. Verdoof de muis met isofluraan (3%-5% voor inductie) in een anesthesiekamer. Nadat u zich voor voldoende anesthesiediepte hebt verzekerd door de reflex van het terugtrekken van het pedaal te testen (beknelling van de voetzolen op beide achterpoten), brengt u het dier over naar een voorbereidingswerkstation. Handhaaf anesthesie boven een neuskegel (1%-2%). Breng hier een oogzalf aan om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen. Controleer regelmatig het verlies van reflexen tijdens de operatie door de pootreflex te controleren.
    2. Als identificatie van het dier vereist is, gebruik dan een oorponsgereedschap of een schaar om de oren te markeren of gebruik een marker om de staart te markeren.
    3. Verwijder de vacht die de schedel tussen de oren en ogen bedekt met een ontharingscrème. Laat de crème zo lang staan als aangegeven (30-60 s) door de fabrikant om huidirritatie te voorkomen. Zorg ervoor dat de crème in contact komt met de haarwortels door deze tegen de haargroeirichting in aan te brengen. Voorkom dat de ontharingscrème in contact komt met de ogen. Verwijder eventuele crème en haarresten door het gebied schoon te maken met zoutoplossing. U kunt ook een tondeuse gebruiken.
    4. Om intra- en postoperatieve pijn, infectie of zwelling te voorkomen, dient u niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's), opioïden, ontstekingsremmende middelen en antibiotica toe. Dien carprofen (5-20 mg/kg, subcutaan [SQ]), buprenorfine - verlengde afgifte (1 mg/kg SQ), cefazoline (20 mg/kg SQ) en dexamethason (0,2 mg/kg SQ) toe vóór de operatie. Dien ongeveer 0,3 ml 0,9% zoutoplossing SQ toe om uitdroging te voorkomen.
    5. Schrob vervolgens het gebied door afwisselend povidonjodium en isopropylalcohol driemaal in cirkelvormige bewegingen van het midden van de schedel naar de periferie te vegen.
  3. Craniotomie procedure
    1. Breng het dier over naar de operatietafel en plaats het in buikligging op een verwarmingskussen (~37 °C) om isotherme omstandigheden tijdens de procedure te garanderen. Onderkoeling bij knaagdieren vermindert de overlevingskansen aanzienlijk en verlengt de postoperatieve herstelfase.
    2. Plaats het hoofd in het stereotactische frame door de oorbalken en snijtanden te plaatsen. Zoek voor de oorbalken de jukbeenboog en steek de staven achter de bogen. Begin met het vastzetten van de contralaterale staaf met de dominante hand (zet bijvoorbeeld de linkerstang vast met uw rechterhand als u rechtshandig bent) en zet vervolgens de andere kant vast. Pas de posities van de oor- en snijtanden aan door indien nodig aan de schroeven te draaien.
    3. Breng indien nodig opnieuw oogzalf aan en gebruik een stuk aluminiumfolie om de ogen te bedekken. Dit voorkomt schade veroorzaakt door het felle microscooplicht en UV-licht dat wordt gebruikt om de cyanoacrylaatlijm later uit te harden (stap 2.5).
    4. Controleer vóór de incisie opnieuw op teenknijpreflex; Pas indien nodig de anesthesie dienovereenkomstig aan. Sluit het dier aan op het anesthesiebewakingsapparaat door de sensor op de achterpoot te plaatsen. Het meten van de hartslag en de zuurstofconcentratie in het bloed zou de mortaliteit helpen verminderen en het postoperatieve herstel verbeteren. Verkrijg bovendien de ademhalingsfrequentie door de beweging van de borstkas visueel te inspecteren.
    5. Bedek het lichaam van het dier met een laken om onderkoeling en besmetting te voorkomen. Voer nog een laatste povidon-jodiumuitstrijkje uit voordat u met de operatie begint.
    6. Trek handschoenen aan en een schone laboratoriumjas.
      OPMERKING: Het gebruik van steriele handschoenen wordt aangemoedigd vanwege de invasiviteit van de procedure en om het risico op postoperatieve infectie en ontsteking te verlagen die resulteert in morbiditeit en verlies van beeldkwaliteit bij 2P-IVM (sectie 5).
    7. Til de huid op de schedel op en maak een incisie door de schaar tussen het rechteroog en het oor te houden en naar de linkerkant van de schedel te knippen na de incisiemarkeringen. Verwijder de resulterende ronde huidflap.
      OPMERKING: Afhankelijk van het interessegebied in de hersenen en de grootte van het venster, kunnen de incisieplaats en diameter variëren. De grootte van de incisie moet groter zijn dan de diameter van het hoofd om ruimte te bieden voor montage (stap 2.5). Indien nodig kan de huid rond de incisie voorzichtig worden ontleed om meer ruimte te creëren.
    8. Verwijder het periosteum door voorzichtig met een scalpelmesje of een microcurrette over het schedeloppervlak te krabben. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het periosteum rond de schedelnaden, aangezien die gebieden kwetsbaar zijn en vatbaarder voor bloedingen. Gebruik zoutoplossing en een stofzuiger om het operatiegebied schoon te houden van vuil. Kras het periosteum om een betere hechting aan de cyanoacrylaatlijm en tandcement te garanderen (stap 2.5)
    9. Identificeer het gebied van de hersenen om de celinjectie uit te voeren. Gebruik hiervoor een atlas van de stereotactische coördinaten van het muizenbrein. Markeer volgens de hersencoördinaten de positie van het schedelvenster met behulp van een biopsiepons in dezelfde diameter als het raam, een chirurgische pen of een autoclaveerpotlood.
    10. Houd de boor in de dominante hand en elk ander instrument (spuit, pincet) in de niet-dominante hand. Vermijd langdurig boren op dezelfde plek. De boor moet in bursts worden gebruikt om oververhitting te voorkomen. Breng tijdens deze pauzes koude zoutoplossing aan op het calvarium om het chirurgische zicht schoon te houden en oververhitting te voorkomen. Gebruik de sensorische feedback van de boorpunt om te detecteren wanneer de schedel volledig is geperforeerd.
    11. Gebruik koude zoutoplossing, in combinatie met een stofzuiger, om het schedeloppervlak schoon te maken. Gebruik geen gaas of een wattenstaafje na het openen van het calvarium, aangezien resten van katoenen draden kunnen leiden tot een reactie van een vreemd lichaam bij het verzegelen van het hersenvenster.
    12. Zorg er tijdens het boren voor dat het traject en de diameter even groot zijn als die van het glazen dekglaasje. Doe dit door het glazen dekglaasje bovenop de schedel te plaatsen en te bevestigen dat het glazen dekglaasje precies in het schedelvenster past.
    13. Zodra het mogelijk is om de schedelflap in te drukken door er zachtjes op te drukken, gebruikt u een tang om het fragment voorzichtig uit het operatieveld te verwijderen (Figuur 1B, links). Als het nog niet mogelijk is om de schedel in te drukken, ga dan door met boren in de delen van het schedelvenster die nog verbonden zijn met de rest van de schedel en evalueer opnieuw.
    14. Als er een kleine bloeding optreedt, gebruik dan een hemostatische spons in combinatie met lichte druk of als alternatief een ijskoude zoutoplossing om bloedverlies te helpen verminderen.
  4. Celimplantatie
    1. Bereid de cellen voor die geïmplanteerd moeten worden en tel ze zoals beschreven in (stap 1.7). Zorg ervoor dat het celnummer 200.000 cellen/μL is.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de cellen op te hangen in een membraanmatrix die stolt bij RT. Dit zal het slagingspercentage van geïmplanteerde cellen in het hersenparenchym verbeteren.
    2. Breng de cellen in een bak met ijs over naar de operatiekamer. Gebruik een gasdichte microliterspuit. Bewaar de spuit voor het opzuigen op ijs om temperatuurverschillen te voorkomen.
    3. Plaats na het opzuigen van 1 μL de spuit in het stereotactische frame.
      OPMERKING: Een geautomatiseerd stereotactisch coördinatenapparaat dat de posities in de X-, Y- en Z-as weergeeft, kan worden gebruikt om tijd te besparen. Het is ook mogelijk om de posities handmatig te berekenen op basis van lambda. Het injecteren van meer dan 1,5 μL wordt niet aanbevolen. Dit zorgt ervoor dat het geïnjecteerde gebied niet overvol raakt, waardoor mislukte implantatie, groei buiten het hersenparenchym of metastasen ontstaan.
    4. Voer implantatie uit in het V2MM-gebied (visuele cortex 2, mediomediaal deel) van de hersenen, wat overeenkomt met ongeveer mediaal tot lateraal (ML): -1,2 tot -1,6 mm, en dorsaal tot ventrale (DV): -2,6 tot -3,5 mm coördinaten.
      1. Voor beeldvorming met twee fotonen (stap 4.6) implanteert u de cellen in de oppervlakkige hersengebieden, zodat de tumormassa later door het schedelvenster kan worden gevisualiseerd. Injecteer 0,5 μL (100.000 cellen) aan de voorkant van het lichaam (A-P): 0,8 mm diepte. Beweeg de naald langzaam, stapsgewijs, bij het binnendringen van de hersenen en wacht 30 seconden na injectie (Figuur 1B, middelste kolom).
      2. Gebruik dezelfde aanpak bij het terugtrekken van de naald en het verlaten van het hersenweefsel. Vermijd injectie in de buurt van de ventrikels, omdat het hersenvocht metastasen in het centrale en perifere zenuwstelsel kan stimuleren.
  5. Sluiting van het schedelraam
    1. Verplaats de hoofdstang en het glazen dekglaasje van alcohol naar een zoutoplossing. Gebruik een vacuümtip of pincet om die componenten naar de plaats van de operatie te navigeren.
    2. Plaats het glazen dekglaasje in het schedelvenster en plaats een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm tussen de schedel en het glazen dekglaasje. UV-geactiveerde cyanoacrylaatlijm verkort de uithardingstijd en voorkomt onbedoelde verplaatsing. Als er lijm op het glazen dekglaasje wordt gemorst, verwijder deze dan met een wattenstaafje of door het voorzichtig af te krabben met de stompe kant van een scalpel voordat het volledig uithardt.
      LET OP: UV-licht is schadelijk voor de ogen en de huid. Vermijd oog- en huidcontact tijdens het uitharden van de lijm.
    3. Nadat u het glazen dekglaasje in het schedelraam hebt bevestigd, brengt u de hoofdbeugel aan. Meng het tweecomponenten tandcement, plaats de hoofdstang en breng het cement aan op de omgeving, zorg voor contact tussen de schedel en de hoofdstang. Reinig overtollig cement voorzichtig met de punt van een spuit, een scalpel of een boorpunt.
      OPMERKING: Tandheelkundig cement stolt zeer snel, dus het is aan te raden om het tijdig aan te brengen.
    4. Ga na het verzegelen van het schedelvenster na of er nog schedelgebieden tussen het tandcement en de huid zichtbaar zijn. Als dat het geval is, breng dan chirurgische lijm aan om de schedel te bedekken door de huid te sluiten. U kunt ook een enkele hechting uitvoeren met een resorbeerbaar hechtmateriaal.

3. Postoperatief herstel en tumorgroei

  1. Terugwinning
    1. Houd het dier in de gaten op een verwarmd kussen in een herstelkooi totdat het weer volledig bij bewustzijn komt. Huisvest de dieren na de operatie apart om het risico op letsel te verminderen.
    2. Dien een hersteldieet toe, zoals in de handel verkrijgbare watergels met elektrolyten of suikers. U kunt ook bevochtigd standaard laboratoriumvoer leveren om gemakkelijke voeding te garanderen en uitdroging en hypoglykemie te voorkomen.
  2. Monitoring
    1. Controleer het dier na herstel dagelijks op tekenen van pijn, angst of infectie. Dien indien nodig pijnstillers, ontstekingsremmende medicijnen of antibiotica toe. Als een dier het eindpunt van het onderzoek bereikt, euthanaseer het dan op humane wijze. Na de laatste beeldvormingssessie euthanaseert u de muis door verstikking door kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie.
      OPMERKING: Voorbeelden van criteria voor vroege euthanasie omvatten, maar zijn niet beperkt tot, aanzienlijk gewichtsverlies (>20%), neurologische aandoeningen, kortademigheid, overmatig bloeden tijdens een operatie of uitgesproken stereotiep gedrag. Inspecteer het schedelraam en reinig het indien nodig met zoutoplossing of alcohol.
    2. Om de tumorgroei te volgen en de beeldvormingstijdstippen te plannen, voert u bioluminescentiebeeldvorming (BLI) van het hele lichaam uit. Injecteer hiervoor intraperitoneaal 150 mg/kg D-luciferine en breng het dier na 5-15 minuten in beeld.

4. Synthese van nanodeeltjes

  1. Voorbereiding van deeltjes
    1. Voeg 11,17 ml Ferumoxytol (6 mmol Fe in totaal) toe aan een oplossing met 50 ml 5 M NaOH, 20 ml gedeïoniseerd water (DI-water) en 20 ml epichloorhydrine. Observeer fasescheiding in dit stadium. Incubeer het mengsel bij RT onder zacht schudden gedurende 24 uur.
    2. Na 24 uur wordt de oplossing uniform. Verwijder overtollig epichloorhydrine met behulp van dialyseslangen (12.000-14.000 Da cutoff) tegen water gedurende 3 dagen.
    3. Breng na de dialyse de oplossing die in de buis achterblijft over in een glazen fles (totaal volume ~110 ml). Voeg 30 ml ammoniakhydroxide toe en roer het mengsel gedurende 18-20 uur op 37 °C.
    4. Herhaal na het roeren de dialyse tegen water gedurende 3 dagen. Breng de oplossing die achterblijft in de dialyseslang over in een nieuwe glazen fles met een totaal volume ~110 ml.
  2. Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugatie
    1. Verwijder 27,5 ml amine-gefunctionaliseerde deeltjes voor FITC-conjugatie. Concentreer de deeltjes met behulp van een ultracentrifugatiefilter van 10 kDa en was ze gedurende 10 minuten met een pH 9 (Na2CO3/NaHCO3) buffer bij 5752 x g bij 25 °C.
    2. Voeg 4 ml van de oplossing toe aan het filter en ultracentrifugeer de buis bij 5752 x g bij 25 °C gedurende 10 minuten. Gooi het filtraat weg en vul het filter opnieuw met buffer voor een tweede wasronde met hetzelfde protocol.
    3. Gooi het filtraat weg en vang de oplossing op in het filter met behulp van een pipet. Schat de molaire concentratie van het deeltje aan de hand van de massaconcentratie van Ferumoxytol, ervan uitgaande dat de diameter van elk deeltje 5 nm is.
    4. Los FITC op in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) in een dosis van 10 mg/ml. Voeg langzaam 1,4 ml DMSO-opgeloste FITC toe aan het geconcentreerde amine-gefunctionaliseerde deeltje. De molaire verhouding van FITC:deeltje is 20:1. Incubeer de oplossing daarna 8 uur in het donker bij 4 °C.
    5. Blus de reactie door overtollig NH3 toe te voegen. H2O (de eindconcentratie van NH3. H2O is 50 mM), en laat de oplossing vervolgens 2 uur in het donker op 4 °C staan. Overtollige FITC wegspoelen met een buffer van Na2CO3/NaHCO3 (pH 9) door een 10 kDa-filter bij 5752 x g bij 25 °C gedurende 10 min. De uiteindelijke pH van de oplossing wordt aangepast tot 7,4 met behulp van HCl-waterige oplossing.

5. 2P-IVM

OPMERKING: Voor de 2P-IVM-sessies werd een Prairie Ultima IV-microscoop gebruikt met een aangepaste tafel (Figuur 2 en aanvullend coderingsbestand 1) waarmee de positie van het schedelvenster horizontaal en verticaal kan worden aangepast. Fiji-software werd gebruikt voor nabewerking en beeldanalyse. Op deze manier kan de laserstraal worden aangepast om het glas in een hoek van 90 ° te raken, waardoor artefacten worden verminderd en de beeldkwaliteit wordt verbeterd.

  1. Imaging sessie
    1. Schakel de Ti-Sapphire laser in. Schakel de hoofdsysteemschakelaar en de Prairie View-software in.
    2. Verdoof het dier, zoals hierboven beschreven (stap 2.2). Voer beeldvormingssessies uit gedurende maximaal 2 uur per dier. Beperk de beeldvormingstijd tot een minimum om het risico op anesthesiecomplicaties en bijbehorende morbiditeit of mortaliteit te verminderen.
    3. Immobiliseer de muis onder de twee-fotonenmicroscoop met behulp van een aangepaste tafel (Figuur 1B, rechterkolom). Plaats het dier in buikligging op een verwarmd kussen dat is ontworpen voor knaagdierchirurgie en zet het lichtjes vast met tape en let erop dat de thorax niet wordt vernauwd. Plaats een druppel water op het schedelraam en pas de scherpstelling aan.
    4. Zorg voor hartslag en bloedoxygenatie om de vitale parameters van de dieren te controleren. Plaats de sensor op de achterpoot en houd het bewakingsapparaat buiten de beeldvormingskamer met twee fotonen.
    5. Zodra het dier zich op de microscooptafel bevindt, past u de positie van de kop aan. Stel met behulp van de verrekijker en breedveldfluorescentieverlichting het RFP-filter (Red Fluorescent Protein) in en zoek het gewenste beeldveld (Figuur 1B, rechterkolom).
    6. Zodra de oriëntatie en het gezichtsveld van het monster zijn bepaald, schakelt u de microscoop over van de breedveldmodus naar de lichtscanningmicroscopiemodus (LSM).
    7. Zorg ervoor dat de Ti-Sapphire-laser is vergrendeld op 920 nm en dat alle luiken open zijn. Breng de GaAsP fotomultiplicator buisdetectoren (PMT) spanningen tot 500-600 V. Gebruik twee PMT's met filtersets met banddoorgangen op 595/50 (RFP) en 525/50.
    8. Druk op Live Image en wijzig langzaam de pokkelcel om het laservermogen bij het monster te verhogen totdat een beeld zichtbaar is.
    9. Zodra een duidelijk beeld is bereikt, gebruikt u de software en de gemotoriseerde tafel om de boven- en onderkant van een afbeeldingsstapel binnen het gewenste monstergebied in te stellen. Let op de stapgrootte en houd er rekening mee dat de Z-as de diepte van de lens aanpast.
    10. Naarmate de diepte toeneemt, worden de beelden donkerder. Verhoog de pockels/PMT-versterking langzaam om het beeld helder te houden. Pas op dat u niet te veel stroom gebruikt, omdat dit kan leiden tot fototoxiciteit en weefselbeschadiging.
    11. Stel een opslagpad in en start de Z-serie. Het zal automatisch naar de begin- en eindpositie gaan met behulp van de ingestelde pockel/PMT-instellingen. Zodra de stapel is voltooid, gebruikt u de weergave om de stapel te controleren op kwaliteit. Zodra het verkrijgen van de benodigde afbeeldingen is voltooid, schakelt u de Ti-Sapphire-laser uit.
    12. Verplaats het dier naar een herstelkooi, zoals hierboven beschreven (stap 3.1).
    13. Sluit de Prairie-weergave af en zorg ervoor dat alle gegevens worden opgeslagen/overgedragen. Sluit de computer af en sluit alle hardware af.
  2. Nabewerking met FIJI
    OPMERKING: Fiji is open-source software gericht op biologische beeldanalyse21.
    1. Download FIJI met betrekking tot het besturingssysteem. Pak de inhoud van de map uit en voer het .exe bestand uit.
    2. Sleep het .env-bestand dat is verzameld uit de afbeelding met twee fotonen naar het dialoogvenster. Splits de kanalen op in verschillende afbeeldingsvakken. Dit creëert twee verschillende afbeeldingen met verschillende kanalen, de ene bevat het celsignaal en de andere het deeltjessignaal.
    3. Kopieer een van de afbeeldingen en klik op Bestand > nieuw > intern klembord om een andere afbeelding te maken. Hernoem een van de afbeeldingen als Bron en de andere als Kopie.
    4. Gebruik de kopieerafbeelding en klik op Verwerken > Contrast verbeteren in het dialoogvenster. Klik op Normaliseren en OK en vervolgens op Verwerken > vloeiend. Deze afbeelding wordt gebruikt om een masker te maken en niet voor analyse. Klik op Afbeelding > Pas > drempel aan in het dialoogvenster. Gebruik de glijdende schaal en methode die geschikt zijn om te extraheren en klik vervolgens op Toepassen.
    5. Gebruik Process > Binary > Erode om enkele pixels op de achtergrond te eroderen en klik op Process > Binary > Dilate om pixels weer aan de afbeelding toe te voegen.
    6. Klik op Process > Image Calculator in het dialoogvenster, selecteer de bronafbeelding als eerste en selecteer de tweede afbeelding als Kopiëren. Gebruik AND om het snijpunt van beide afbeeldingen te maken. Herhaal dezelfde stap voor de afbeelding van het andere kanaal.
    7. Voor signaalanalyse buiten het vasculaire gebied opent u een ongewijzigde gekopieerde afbeelding en verwijdert u het vasculaire gebied van het signaal met de ROI-tool uit de vrije hand.
    8. Stel de gewenste parameters in door naar Analyseren > Metingen instellen te gaan. Zorg ervoor dat Oppervlakte, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde zijn aangevinkt.
    9. Analyseer nu door Analyze > Measure. Er verschijnt een venster met de metingen. Kopieer de gegevens naar een spreadsheet.
    10. Selecteer nu een klein deel van de afbeelding dat geen fluorescentie heeft. Dit zal de achtergrond zijn.
    11. Klik op Analyseren > meten voor die regio. Kopieer gegevens naar een spreadsheet.
    12. Sla de resulterende afbeelding op als Bestand > Opslaan als > Analyseer bestandstype voor hermetingen of publicatiedoeleinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier voerden we craniale raamchirurgie uit en transplanteerden we C6-cellen in een NSG-muismodel van GBM (n = 5). Een goede afdichting tussen alle componenten die betrokken zijn bij het maken van het venster (Figuur 1A) zorgt voor de duurzaamheid van de ramen voor beeldvorming op lange termijn en vermindert bovendien de morbiditeit. Met behulp van de voor in vivo 2P-IVM aangepaste fase (Figuur 2) konden we dieren tot 2 uur lang onder narcose in beeld br...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een methode voor real-time in vivo NP-tracking met behulp van 2P-IVM door een craniaal venster om de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide NP's te evalueren. De chirurgische techniek voor deze procedure vereist een vaste hand en geavanceerde experimentele chirurgische vaardigheden. Het is raadzaam om te oefenen met het gebruik van karkassen of fantomen voordat u verder gaat met het ervaren van levende dieren. Als alternatief implementeerden Hoeferlin et al. een robotboor om thermisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

We willen de Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, het Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - centrum voor beeldvorming van kleine dieren, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) en Stanford Preclinical Imaging Facility in Porter Drive bedanken voor het leveren van de apparatuur en infrastructuur voor dit project. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute for Child Health and Human Development, subsidienummer R01HD103638. We willen de Schnitzer Group, Stanford University, bedanken; het Zuo-lab, Universiteit van Santa Cruz; en het Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, voor educatieve discussies over beeldvorming met twee fotonen en craniale raammodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% natriumchloride infuusioplossingBaxter Corp533-JB1301P

Dulbecco's Modified Eagle Medium		Invitrogen11965-092
1 mL spuitenBDLuer-Lok spuit, REF309628
10% FBSThermo fisherCytiva SH30910.03HI
10% DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
2-foton microscoopPrairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%Medline Industries, LPMDS093810
Alcohol, spuitflesDecon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
AluminiumfolieReynold BrandsReynold Wrap non-stick aluminiumfolie
AnesthesiemachinePatterson ScientificSAS3
Anesthesiemonitoring Kent Scientific MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibioticum-Antimycoticum (100x), vloeibaarInvitrogen15240-096
Betadine applicatorsProfessional Disposables International, IncS41125
Biopsie punch, 5 mm MiltexSize 5
Buprenorfine met verlengde afgifteZoo PharmBup SR Lab, 1.0 mg/mLEen generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt. 
C6 rat glioma cel lijnATCC (American Tissue Culture Collection)CCL-107
CanulesBD16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
CarprofenPfizer Rimadyl, 50 mg/mlEen generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt. 
CefazolineSagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/vialEen generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt. 
Cell strainer, 40 µmFisher Scientific87711
Katoenen punt applicators, 6” Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
TandcementStoelting Co51459Tandcement kit, transparant, 2 componenten
DexamethasonBimeda138RX, 2 mg/mLEen generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt. 
DietGelClearH2ORecovery, 72-06-502
Drape Cardinal HealthBio Shield Wrap
BoorSaeyang MicrotechEscort Pro, B08350
Boortips Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005Size 005, US 1/4
FIJI beeldanalyse softwareNational Institute of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/
PincettenFisher Scientific13-812-41
GaasjesFisher HealthCareSteriele katoenen gaasjes, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam Ethicon Inc. Surgifoam absorbable gelatine spons, Ref. 1972
Germinator Cellpoint Scientific Germinator 500, No. 11688
Glas dekglasjes, 5 mm diameterFisher ScientificMenzel Cover glass 
Handschoenen, niet-sterieelFisher ScientificNitrile poedervrije medische onderzoekshandschoenen
Handschoenen, sterieelMedline Industries, LPMDS104070
HaarverwijderingscrèmeChurch & DwightNair Hair remover lotion 
Hamilton spuitHamilton Company IncGastight #1701, 10 µL
HBSS zonder Ca, MgFisher ScientificPI88284
HoofdbalkHongway5 mm binnendiameter O-ringen
VerwarmingskussenStoelting Co. Rodent warmer X2
Insulin spuitenExel International Medical Products 29G x 1/2″
Ijzeroxide nanodeeltjesCovis Pharma GmbHFeraheme ferumoxytol injectie, 510 mg/17 mL, 59338077501
IsofluraanDechra26675-46-7
MuizenJackson LaboratoriesNSG, Strain 005557
Microscoop (chirurgie)Seiler MedicalSeiler IQ Q-100-220
NanodeeltjesCustomIjzeroxide nanodeeltjes (Ferumoxytol) gelabeld met fluoresceïne isothiocyanate
Ophtalmisch zalfjeMajor pharmaceuticalsLubrifresh P.M. nachtogent, 203964
ZuurstofLinde Gas & Equipment Inc. High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Kunststof bekertjesGeorgia-Pacirif Consumer ProductsDixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethyleen buisjesBraintree Scientific50-195-5494
WeegschaalOhaus CorpCR2200
SchaarFisher Scientific13-804-18
ZegelmiddelHenkel CorpLoctite 4014
Labjas, voor eenmalig gebruikHigh Tech Conversions17-444-081
Stereotactisch frameStoelting Co. Stoelting New Standard TM
Steriele vacuümflesjes met bovenfiltersystemenFisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam doosN/AN/A
Chirurgische handschoenenCardinal Health19-163-108
Chirurgisch lijm, 3M Vetbond weefselkleefstof3M Animal Care Prodcuts1469SB

Referenties

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970(2021).
  3. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).
  4. Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).
  5. Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).
  6. Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).
  7. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694(2017).
  8. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
  9. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
  10. Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
  11. Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
  12. Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276(2014).
  13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
  14. Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381(2016).
  15. Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).
  16. Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
  17. Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556(2021).
  18. Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
  19. Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
  20. Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188(2022).
  23. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818(2016).
  25. Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
  26. Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678(2021).
  27. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  28. Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
  29. Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
  30. Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
  31. Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972(2008).
  32. Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
  33. Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Twee-fotonmicroscopieglioblastoommodelbeeldvorming van hersentumorenbloed-hersenbarrièretoediening van nanodeeltjescraniaal vensterfluorescerende nanodeeltjesstereotactische chirurgiereal-time beeldvorming
Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.