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Article de méthode

Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

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DOI :

10.3791/66304

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1 mars 2024

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1Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley, 3Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 4Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University, Wu Tsai Neuroscience Institute, Stanford University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une nouvelle approche pour la microscopie à deux photons de l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence au glioblastome dans un modèle murin.

Résumé

L’administration de traitements anticancéreux administrés par voie intraveineuse aux tumeurs cérébrales est limitée par la barrière hémato-encéphalique. Une méthode permettant d’imager directement l’accumulation et la distribution des macromolécules dans les tumeurs cérébrales in vivo améliorerait considérablement notre capacité à comprendre et à optimiser l’administration de médicaments dans des modèles précliniques. Ce protocole décrit une méthode de suivi in vivo en temps réel de nanoparticules marquées par fluorescence administrées par voie intraveineuse avec microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) dans un modèle murin de glioblastome (GBM).

Le protocole contient une description en plusieurs étapes de la procédure, y compris l’anesthésie et l’analgésie des animaux de laboratoire, la création d’une fenêtre crânienne, l’implantation de cellules GBM, la mise en place d’une barre de tête, la réalisation d’études 2P-IVM et les soins post-chirurgicaux pour les études de suivi à long terme. Nous montrons des sessions d’imagerie 2P-IVM représentatives et des analyses d’images, examinons les avantages et les inconvénients de cette technologie et discutons des applications potentielles.

Cette méthode peut être facilement modifiée et adaptée à différentes questions de recherche dans le domaine de l’imagerie cérébrale préclinique in vivo .

Introduction

La microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) est une technique d’imagerie par fluorescence qui permet de visualiser les tissus vivants1.

Développé pour la première fois dans les années 1990, le 2P-IVM a été utilisé pour l’analyse in vivo de la rétine2, du rein3, de l’intestin grêle4, de la cochlée5, du cœur6, de la trachée7 et du cerveau dans divers modèles précliniques 8,9. Dans le domaine des neurosciences, la 2P-IVM a gagné en importance en tant que technique d’imagerie en temps réel du cerveau sain chez les animaux éveillés10, ainsi que pour l’étude des maladies du système nerveux telles que la maladie d’Alzheimer11, la maladie de Parkinson12 et le glioblastome (GBM)13,14,15,16.

La 2P-IVM offre une solution élégante pour étudier le microenvironnement tumoral pendant le développement du GBM. Alors que certaines études antérieures se sont concentrées sur des modèles in vitro17 et ex vivo 18, d’autres ont mis en œuvre des modèles orthotopiques19 et xénotropes20 in vivo pour examiner le GBM. Madden et al. ont effectué une imagerie native de la lignée cellulaire de gliome de rat CNS-1 dans un modèle murin13. À l’aide d’un modèle murin orthotopique GL261-DsRed, Ricard et al. ont effectué une administration intraveineuse d’un fluorophore pour améliorer les vaisseaux sanguins de la région tumorale dans 2P-IVM14.

Ici, nous appliquons la 2P-IVM pour suivre l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer (NP) marquées par fluorescence dans un modèle murin orthotopique de GBM. À l’aide d’une fenêtre crânienne, cette méthode nous permet d’étudier en détail la distribution spatio-temporelle en temps réel des NPs dans le cerveau.

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Protocole

La procédure animale décrite dans ce protocole est conforme aux exigences du Groupe administratif sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC).

1. Culture cellulaire

  1. Préparation de la hotte
    1. Lavez-vous les mains, portez des gants et une blouse de laboratoire. Allumez l’enceinte de sécurité biologique et réglez le niveau du châssis à une hauteur d’ouverture appropriée. Laissez la hotte purger pendant 3 à 5 minutes. Vaporisez la zone de la hotte avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-la avec du papier de soie.
    2. Vaporisez tous les réactifs avec de l’éthanol à 70 % et essuyez avec du papier de soie. Déplacez les réactifs dans la hotte. Ne mettez aucun article sur le gril. Si un déversement se produit dans la hotte, couvrez-la de lingettes, vaporisez-la d’éthanol à 70 % et essuyez à nouveau.
    3. Après l’expérience, fermez soigneusement les couvercles de chaque article, essuyez tous les matériaux, retirez tous les articles de la hotte et transférez-les à leur emplacement d’origine. Vaporisez de l’éthanol à 70 % dans la hotte et essuyez-la. Fermez le châssis et éteignez l’enceinte de sécurité biologique.
  2. Préparation d’un milieu de culture
    1. Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal à 100 % à 500 ml de milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM). Ajouter 5 mL de solution antibiotique-antimycosique (100x).
    2. Passer tous les réactifs dans un flacon filtrant stérile de 500 mL (filtre de 0,22 μm).
  3. Décongélation de cellules cryoconservées
    1. Dans une hotte à flux laminaire, ajouter 20 mL du milieu de culture dans une fiole T75. Étiquetez le ballon avec le nom des cellules, la date et le numéro de passage sur le ballon. Dans cette étude, des cellules de gliome C6 adhérentes ont été utilisées.
    2. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37 °C. Ne vortex pas les cellules. Décongelez et utilisez immédiatement les cellules.
    3. Transférez les cellules décongelées dans la fiole T75 à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL. Veillez à ne pas introduire de bulles pendant le processus de transfert et évitez tout résidu de fluide dans le col du flacon. Cela pourrait augmenter le risque de contamination possible.
  4. Changer de support
    1. Changez le milieu le lendemain de la décongélation pour éliminer toute trypsine ou diméthylsulfoxyde (DMSO) résiduel (étape 1.6). Par la suite, changez de milieu au moins deux fois par semaine ou plus, selon le niveau de confluence des cellules. Le milieu doit être changé un jour après le passage pour éliminer la trypsine.
    2. Pour changer de milieu, allumez l’appareil d’aspiration, fixez la pipette en verre d’aspiration et aspirez tout le milieu.
    3. Ajouter 20 mL du milieu de culture (étape 1.2).
  5. Passage des cellules
    1. Chargez la hotte avec les objets nécessaires au cours de l’expérience.
    2. Utilisez une pipette en verre d’aspiration et aspirez tous les supports, en vous assurant que la pipette en verre se trouve du côté non cellulaire du flacon. Pour cette étape, positionnez la gourde T75 verticalement.
    3. Ajouter ~10 mL de solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante (sans PBS, Ca++ et Mg++ ) ou de solution saline équilibrée de Hanks (sans HBSS, Ca++ et Mg++ ) du côté non cellulaire. Lavez brièvement les cellules avec du PBS en positionnant la fiole T75 horizontalement avec le côté de la cellule vers le bas.
    4. Placer immédiatement la fiole à la verticale et aspirer le PBS/HBSS. Répétez ce lavage et cette aspiration 3 fois.
    5. Ajouter 2 mL de trypsine (recombinante ou d’origine animale) sur le côté cellulaire (fiole T75 horizontale, côté cellulaire vers le bas). Incuber dans un incubateur de culture tissulaire standard (37 °C, 5 % de CO2) pendant 4 min. Triturez-le une fois après 2 min à l’aide d’une pipette de 5 ml.
    6. Après 4 min d’incubation totale, transférer la solution dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 8 mL de la solution de croissance dans le tube conique (2 mL de cellules trypsinisées + 8 mL de milieu = 10 mL au total).
    7. Utilisez un autre tube conique vide de 15 ml avec un filtre et transférez les cellules via une pipette de 25 ml pour obtenir des cellules individuelles.
    8. Transférer 1/10 (1 mL) de la solution (cellule + milieu + Tryp-LE) dans une fiole T75 avec 20 mL de milieu. Vous pouvez également compter les cellules (étape 1.7). Changez le milieu le lendemain pour avoir une solution de milieu sans trypsine.
  6. Congélation du milieu et des cellules
    1. Décongeler 100 % FBS dans un réfrigérateur à 4 °C. N’utilisez pas de bain-marie ou de chaleur car cela pourrait endommager les protéines du FBS.
    2. Pour préparer 50 mL de milieu de congélation, mélanger 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS et 5 mL de DMSO. Faites-le passer dans des contenants de 1 à 2 ml pour éviter la décongélation intermittente et les dommages aux protéines. Conservez-les au congélateur à -20° ou -80°C.
    3. Pour les 9 ml de solution restants (étape 1.5), ajouter 1 ml de milieu pour atteindre 10 ml au total. Centrifuger à 300 x g pendant 4 min.
    4. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de milieu de congélation (voir ci-dessus). Placez les cellules dans un récipient de congélation au congélateur à -80 °C. Déplacez les cellules dans le liquide N2 pour un stockage à long terme après 1 ou 2 jours.
  7. Compter les cellules
    1. Pour les 9 ml restants (étape 1.5), ajoutez 1 ml de média pour atteindre 10 ml au total. Centrifuger à 300 x g pendant 4 min.
    2. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 4 mL de HBSS. Remettre en suspension 10 μL de cellules dans 80 μL de HBSS + 10 μL de bleu de trypan à 0,4 %, facteur de dilution = 10.
    3. Prélever 17 μL de solution et compter quatre carrés 4 x 4 dans un hémocytomètre. Compte moyen pour les quatre carrés 4 x 4 et multipliez par 104x facteur de dilution pour obtenir des cellules/ml.

2. Chirurgie

REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer la chirurgie par deux chercheurs, où une personne est responsable de la préparation des cellules, du mélange du ciment dentaire et de l’assistance générale à la procédure, tandis que la deuxième personne se concentre sur le maintien de la stérilité. Le fait d’avoir un deuxième manipulateur pour aider à l’intervention chirurgicale réduit considérablement le risque de contamination. Le respect des meilleures pratiques chirurgicales réduirait les risques de complications postopératoires. La figure 1A donne un aperçu des composants de la fenêtre crânienne.

  1. Préparatifs généraux
    1. Confirmez que la procédure est approuvée par les directives institutionnelles locales en matière de bien-être animal avant de commencer.
      REMARQUE : Cette étude a utilisé des souris NSG femelles âgées de 5 mois (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
    2. Avant la chirurgie, autoclavez tous les instruments chirurgicaux et assurez-vous que toutes les fournitures nécessaires sont disponibles. Imprimez les dossiers d’anesthésie et de chirurgie.
    3. Assurez-vous qu’à leur arrivée, les animaux ont au moins 1 semaine d’acclimatation à la salle d’élevage pour réduire la détresse postopératoire supplémentaire.
    4. Le jour de l’intervention, assurez-vous que tous les appareils (microscope, coussin chauffant, stérilisateur, perceuse, aspirateur, etc.) sont prêts à l’emploi. Confirmez que l’appareil d’anesthésie contient suffisamment d’isoflurane et remplissez-le si nécessaire. Pour les nouveaux utilisateurs, la procédure de fenêtre crânienne peut prendre jusqu’à 2 heures par animal ; par conséquent, il est crucial d’avoir suffisamment d’isoflurane.
    5. Placez les fenêtres en verre et les barres de tête dans de l’alcool et préparez un récipient avec du sérum physiologique. Cela garantira un flux de travail fluide sans aucune violation majeure de la stérilité et réduira au maximum le temps d’anesthésie pour chaque animal.
    6. Ouvrir tout le matériel chirurgical sur une surface stérile sur le poste de travail. Par exemple, l’intérieur d’un emballage de gaze stérile peut être utilisé à cette fin. Utilisez la technique des pourboires seulement. Lorsque vous n’utilisez pas d’instruments chirurgicaux, placez les embouts sur une surface stérile, comme l’intérieur de l’emballage de la gaze stérile.
    7. Lorsque vous effectuez plusieurs interventions chirurgicales, placez tous les instruments chirurgicaux dans le stérilisateur entre les interventions chirurgicales pour les désinfecter. Lorsque vous effectuez des interventions chirurgicales sur plus de 5 animaux, utilisez un nouvel ensemble d’instruments autoclavés. Remplacez la pointe de la perceuse lorsqu’elle s’émousse par une nouvelle pour éviter les traumatismes tissulaires.
  2. Anesthésie et préparation à la chirurgie
    REMARQUE : La configuration de l’anesthésie est identique pour la chirurgie, ainsi que pour l’imagerie.
    1. Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane (3 % à 5 % pour l’induction) dans une chambre anesthésique. Après avoir vérifié une profondeur anesthésique adéquate en testant le réflexe de retrait de la pédale (pincement des coussinets sur les deux pattes arrière), transférez l’animal à un poste de travail de préparation. Maintenez l’anesthésie au-dessus d’un cône nasal (1 % à 2 %). Ici, appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir les lésions cornéennes. Contrôlez régulièrement la perte de réflexes pendant la chirurgie en vérifiant le réflexe de la patte.
    2. Si une identification de l’animal est requise, utilisez un poinçon d’oreille ou des ciseaux pour marquer les oreilles ou utilisez un marqueur pour marquer la queue.
    3. Retirez la fourrure recouvrant le crâne entre les oreilles et les yeux avec une crème dépilatoire. Laissez la crème aussi longtemps que indiqué (30-60 s) par le fabricant pour éviter toute irritation de la peau. Assurez-vous que la crème entre en contact avec les racines des cheveux en l’appliquant dans le sens inverse de la pousse des cheveux. Évitez que la crème dépilatoire n’entre en contact avec les yeux. Enlevez les restes de crème et de cheveux en nettoyant la zone avec une solution saline. Vous pouvez également utiliser une tondeuse.
    4. Pour éviter toute douleur, infection ou gonflement per- et postopératoire, administrez des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), des opioïdes, des agents anti-inflammatoires et des antibiotiques. Administrer du carprofène (5-20 mg/kg, sous-cutané [SQ]), de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg SQ), de la céfazoline (20 mg/kg SQ) et de la dexaméthasone (0,2 mg/kg SQ) avant la chirurgie. Administrer environ 0,3 mL de SQ de solution saline à 0,9 % pour éviter la déshydratation.
    5. Ensuite, frottez la zone en tamponnant alternativement de la povidone iodée et de l’alcool isopropylique trois fois en mouvements circulaires du milieu du crâne vers la périphérie.
  3. Procédure de craniotomie
    1. Transférez l’animal sur la table d’opération et placez-le en position ventrale sur un coussin chauffant (~37 °C) pour assurer des conditions isothermes pendant l’intervention. L’hypothermie chez les rongeurs réduit considérablement les taux de survie et prolonge la phase de récupération postopératoire.
    2. Placez la tête dans le cadre stéréotaxique en positionnant les barres d’oreille et les incisives. Pour les barres auriculaires, trouvez l’arc zygomatique et insérez les barres derrière les arcs. Commencez par fixer la barre controlatérale avec la main dominante (par exemple, fixez la barre gauche avec votre main droite si vous êtes droitier), puis fixez le côté opposé. Ajustez les positions des barres d’oreille et d’incisives en tournant les vis si nécessaire.
    3. Réappliquez la pommade oculaire si nécessaire et utilisez un morceau de papier d’aluminium pour couvrir les yeux. Cela évitera tout dommage causé par la lumière vive du microscope et la lumière UV utilisée pour durcir la colle cyanoacrylate plus tard (étape 2.5).
    4. Avant l’incision, vérifiez à nouveau le réflexe de pincement des orteils ; Si nécessaire, ajustez l’anesthésie en conséquence. Connectez l’animal au dispositif de surveillance de l’anesthésie en positionnant le capteur sur la patte arrière. La mesure de la fréquence cardiaque et de la concentration d’oxygène dans le sang aiderait à réduire la mortalité et à améliorer la récupération postopératoire. De plus, obtenez la fréquence respiratoire en inspectant visuellement le mouvement de la poitrine.
    5. Couvrez le corps de l’animal avec un drap pour éviter l’hypothermie et la contamination. Effectuez un dernier prélèvement de povidone iodée avant de commencer la chirurgie.
    6. Mettez des gants et une blouse de laboratoire propre.
      REMARQUE : L’utilisation de gants stériles est encouragée en raison du caractère invasif de l’intervention et pour réduire le risque d’infection et d’inflammation postopératoires entraînant une morbidité et une perte de qualité d’image dans la 2P-IVM (section 5).
    7. Soulevez la peau du crâne et créez une incision en tenant les ciseaux entre l’œil droit et l’oreille et en coupant vers le côté gauche du crâne en suivant les marques d’incision. Retirez le lambeau de peau rond obtenu.
      REMARQUE : Selon la région d’intérêt dans le cerveau et la taille de la fenêtre, le site d’incision et le diamètre peuvent varier. La taille de l’incision doit être plus grande que le diamètre de la tête pour permettre le montage (étape 2.5). Si nécessaire, la peau entourant l’incision peut être disséquée doucement pour créer plus d’espace.
    8. Retirez le périoste en grattant doucement la surface du crâne avec une lame de scalpel ou une microcurrette. Faites preuve de prudence lorsque vous retirez le périoste autour des sutures crâniennes, car ces zones sont fragiles et plus sujettes aux saignements. Utilisez une solution saline et un aspirateur pour garder la zone chirurgicale propre des débris. Grattez le périoste pour assurer une meilleure adhérence à la colle cyanoacrylate et au ciment dentaire (étape 2.5)
    9. Identifiez la région du cerveau pour effectuer l’injection cellulaire. Pour cela, utilisez un atlas des coordonnées stéréotaxiques du cerveau de la souris. Selon les coordonnées cérébrales, marquez la position de la fenêtre crânienne à l’aide d’un poinçon de biopsie du même diamètre que la fenêtre, d’un stylo chirurgical ou d’un crayon autoclave.
    10. Tenez la perceuse dans la main dominante et tout autre instrument (seringue, pince) dans la main non dominante. Évitez de percer longtemps au même endroit. La perceuse doit être utilisée en rafales pour éviter la surchauffe. Pendant ces pauses, appliquez une solution saline froide sur le calvarium pour garder la vue chirurgicale propre et éviter la surchauffe. Utilisez le retour sensoriel de la pointe de la perceuse pour détecter quand le crâne a été complètement perforé.
    11. Utilisez une solution saline froide, en combinaison avec un aspirateur, pour nettoyer la surface du crâne. N’utilisez pas de gaze ou d’applicateur de coton-tige après avoir ouvert le calvarium, car les restes de fils de coton peuvent entraîner une réaction à un corps étranger lors du scellement de la fenêtre du cerveau.
    12. Pendant le perçage, assurez-vous que la trajectoire et le diamètre sont de la même taille que ceux de la lamelle de verre. Pour ce faire, placez la lamelle en verre sur le dessus du crâne et en confirmant que la lamelle en verre s’insère exactement à l’intérieur de la fenêtre crânienne.
    13. Une fois qu’il est possible d’enfoncer le lambeau du crâne en appuyant doucement dessus, utilisez une pince pour retirer soigneusement le fragment du champ opératoire (Figure 1B, à gauche). S’il n’est pas encore possible d’enfoncer le crâne, continuez à percer dans les zones de la fenêtre crânienne qui sont encore reliées au reste du crâne et réévaluez.
    14. En cas de saignement mineur, utilisez une éponge hémostatique combinée à une légère pression ou à une solution saline glacée, pour aider à réduire la perte de sang.
  4. Implantation cellulaire
    1. Préparez et comptez les cellules à implanter comme décrit à l’étape 1.7. Assurez-vous que le nombre de cellules est de 200 000 cellules/μL.
      REMARQUE : Il est recommandé de suspendre les cellules dans une matrice membranaire qui se solidifie à la RT. Cela améliorera le taux de réussite des cellules implantées dans le parenchyme cérébral.
    2. Transférez les cellules dans un récipient avec de la glace dans la salle d’opération. Utilisez une seringue étanche au gaz. Avant l’aspiration, gardez la seringue sur de la glace pour éviter les différences de température.
    3. Après avoir aspiré 1 μL, positionner la seringue à l’intérieur du cadre stéréotaxique.
      REMARQUE : Un dispositif de coordonnées stéréotaxiques automatisé indiquant les positions dans les axes X, Y et Z peut être utilisé pour gagner du temps. Il est également possible de calculer manuellement les positions en fonction de lambda. L’injection de plus de 1,5 μL n’est pas recommandée. Cela garantira que la zone injectée ne se remplit pas trop, provoquant une implantation infructueuse, une croissance en dehors du parenchyme cérébral ou des métastases.
    4. Effectuer une implantation dans la région V2MM (cortex visuel 2, partie médiomédiale) du cerveau, qui correspond approximativement aux coordonnées médiales à latérales (M-L) : -1,2 à -1,6 mm, et dorsale à ventrale (D-V) : -2,6 à -3,5 mm.
      1. Pour l’imagerie à deux photons (étape 4.6), implantez les cellules dans les zones superficielles du cerveau afin que la masse tumorale puisse être visualisée à travers la fenêtre crânienne plus tard. Injecter 0,5 μL (100 000 cellules) de l’avant vers l’arrière (A-P) : 0,8 mm de profondeur. Déplacer l’aiguille lentement, par étapes, en entrant dans le cerveau et attendre 30 s après l’injection (Figure 1B, colonne du milieu).
      2. Utilisez la même approche lorsque vous rétractez l’aiguille et sortez du tissu cérébral. Évitez d’injecter près des ventricules, car le liquide céphalo-rachidien pourrait favoriser la métastase dans les systèmes nerveux central et périphérique.
  5. Fermeture de la fenêtre crânienne
    1. Déplacez la barre de tête et la lamelle en verre de l’alcool vers une solution saline. Utilisez une pointe à vide ou une pince pour faire naviguer ces composants vers le site chirurgical.
    2. Placez la lamelle en verre à l’intérieur de la fenêtre crânienne et placez une petite quantité de colle cyanoacrylate entre le crâne et la lamelle en verre. La colle cyanoacrylate activée par les UV réduit le temps de durcissement et évite les déplacements accidentels. Si de la colle se renverse sur la lamelle en verre, retirez-la avec un applicateur à embout en coton ou en la grattant doucement avec le côté émoussé d’un scalpel avant qu’elle ne durcisse complètement.
      ATTENTION : Les rayons UV sont nocifs pour les yeux et la peau. Évitez le contact avec les yeux et la peau pendant le durcissement de la colle.
    3. Après avoir fixé la lamelle en verre dans la fenêtre crânienne, appliquez la barre de tête. Mélangez le ciment dentaire à deux composants, positionnez la barre de tête et appliquez le ciment sur la zone environnante, en assurant le contact entre le crâne et la barre de tête. Nettoyez soigneusement tout ciment superflu avec la pointe d’une seringue, d’un scalpel ou d’une pointe de foret.
      REMARQUE : Le ciment dentaire se solidifie très rapidement, il est donc conseillé de l’appliquer en temps opportun.
    4. Après avoir scellé la fenêtre crânienne, identifiez si des zones du crâne entre le ciment dentaire et la peau sont encore exposées. Si c’est le cas, appliquez de la colle chirurgicale pour couvrir le crâne en fermant la peau. Vous pouvez également effectuer une seule suture avec un matériau de suture résorbable.

3. Récupération post-chirurgicale et croissance tumorale

  1. Récupération
    1. Surveillez l’animal sur un coussin chauffant dans une cage de récupération jusqu’à ce qu’il reprenne pleinement conscience. Hébergez les animaux séparément après la chirurgie pour réduire le risque de blessure.
    2. Administrer un régime de récupération, comme des gels d’eau disponibles dans le commerce avec des électrolytes ou des sucres. Vous pouvez également fournir de la nourriture de laboratoire standard humidifiée pour assurer une nutrition facile et éviter la déshydratation et l’hypoglycémie.
  2. Surveillance
    1. Une fois rétabli, surveillez quotidiennement l’animal pour détecter des signes de douleur, de détresse ou d’infection. Si nécessaire, administrez des analgésiques, des anti-inflammatoires ou des antibiotiques. Si un animal atteint le point final de l’étude, euthanasiez-le sans cruauté. Après la dernière séance d’imagerie, euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale.
      REMARQUE : Les exemples de critères d’euthanasie précoce comprennent, sans s’y limiter, une perte de poids importante (>20 %), des troubles neurologiques, une dyspnée, des saignements excessifs pendant la chirurgie ou un comportement stéréotypé prononcé. Inspectez la fenêtre crânienne et nettoyez-la avec une solution saline ou de l’alcool si nécessaire.
    2. Pour suivre la croissance tumorale et planifier les points temporels d’imagerie, effectuez une imagerie de bioluminescence du corps entier (BLI). Pour cela, injecter 150 mg/kg de D-luciférine par voie intrapéritonéale et imager l’animal après 5 à 15 min.

4. Synthèse de nanoparticules

  1. Préparation des particules
    1. Ajouter 11,17 mL de Ferumoxytol (6 mmol Fe au total) à une solution contenant 50 mL de 5 M de NaOH, 20 mL d’eau désionisée (eau DI) et 20 mL d’épichlorhydrine. Observez la ségrégation des phases à ce stade. Incuber le mélange à RT en secouant doucement pendant 24 h.
    2. Après 24 h, la solution devient uniforme. Éliminer l’excès d’épichlorhydrine à l’aide d’une tubulure de dialyse (seuil de 12 000 à 14 000 Da) contre l’eau pendant 3 jours.
    3. Après la dialyse, transférez la solution restante dans le tube dans un flacon en verre (volume total ~110 ml). Ajouter 30 mL d’hydroxyde d’ammoniac et remuer le mélange à 37 °C pendant 18 à 20 h.
    4. Après avoir agité, répétez la dialyse contre l’eau pendant 3 jours. Transférez la solution restante dans la tubulure de dialyse dans un nouveau flacon en verre d’un volume total de ~110 ml.
  2. Conjugaison de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)
    1. Retirer 27,5 mL de particules fonctionnalisées aux amines pour la conjugaison FITC. Concentrer les particules à l’aide d’un filtre d’ultracentrifugation de 10 kDa et laver avec un tampon pH 9 (Na2, CO3/NaHCO3) à 5752 x g à 25 °C pendant 10 min.
    2. Ajouter 4 mL de solution dans le filtre et ultracentrifuger le tube à 5752 x g à 25 °C pendant 10 min. Jetez le filtrat et remplissez à nouveau le filtre de tampon pour un deuxième cycle de lavage avec le même protocole.
    3. Jetez le filtrat et collectez la solution dans le filtre à l’aide d’une pipette. Estimez la concentration molaire de la particule par la concentration massique de Ferumoxytol, en supposant que le diamètre de chaque particule est de 5 nm.
    4. Dissoudre le FITC dans le diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à raison de 10 mg/mL. Ajouter lentement 1,4 mL de FITC dissous dans le DMSO dans la particule concentrée fonctionnalisée par des amines. Le rapport molaire de FITC :particule est de 20:1. Ensuite, incubez la solution à 4 °C pendant 8 h dans l’obscurité.
    5. Éteignez la réaction en ajoutant un excès de NH3. H2O (la concentration finale de NH3. H2O est de 50 mM), puis en laissant la solution à 4 °C dans l’obscurité pendant 2 h. Éliminer l’excès de FITC à l’aide d’un tampon Na2CO3/NaHCO3 (pH 9) à travers un filtre de 10 kDa à 5752 x g à 25 °C pendant 10 min. Le pH final de la solution est ajusté à 7,4 à l’aide d’une solution aqueuse de HCl.

5. 2P-IVM

REMARQUE : Pour les séances de 2P-IVM, un microscope Prairie Ultima IV avec une platine personnalisée (figure 2 et fichier de codage supplémentaire 1) qui permet d’ajuster la position de la fenêtre crânienne horizontalement et verticalement a été utilisé. Un logiciel fidjien a été utilisé pour le post-traitement et l’analyse des images. De cette façon, le faisceau laser peut être ajusté pour frapper le verre à un angle de 90 °, réduisant les artefacts et améliorant la qualité de l’image.

  1. Séance d’imagerie
    1. Allumez le laser Ti-Sapphire. Allumez le commutateur système principal et le logiciel Prairie View.
    2. Anesthésier l’animal, comme décrit ci-dessus (étape 2.2). Effectuez des séances d’imagerie jusqu’à 2 h par animal. Réduisez au minimum le temps d’imagerie pour réduire le risque de complications de l’anesthésie et de morbidité ou de mortalité associée.
    3. Immobilisez la souris sous le microscope à deux photons à l’aide d’une platine personnalisée (Figure 1B, colonne de droite). Placez l’animal en position couchée sur un coussin chauffant conçu pour la chirurgie des rongeurs et fixez-le légèrement à l’aide de ruban adhésif tout en faisant attention à ne pas contracter le thorax. Placez une goutte d’eau sur la fenêtre crânienne et ajustez la mise au point.
    4. Acquérir la fréquence cardiaque et l’oxygénation du sang pour surveiller les paramètres vitaux des animaux. Placez le capteur sur la patte arrière et maintenez le dispositif de surveillance à l’extérieur de la chambre d’imagerie à deux photons.
    5. Une fois que l’animal est sur la platine du microscope, ajustez la position de la tête. À l’aide des jumelles et de l’éclairage fluorescent à grand champ, réglez le filtre de la protéine fluorescente rouge (RFP) et trouvez le champ de vision d’imagerie souhaité (Figure 1B, colonne de droite).
    6. Une fois l’orientation de l’échantillon et le champ de vision déterminés, passez du mode grand champ au mode microscopie à balayage optique (LSM).
    7. Assurez-vous que le laser Ti-Sapphire est verrouillé en mode à 920 nm et que tous les obturateurs sont ouverts. Amenez les détecteurs à tube photomultiplicateur (PMT) GaAsP à des tensions allant jusqu’à 500-600 V. Utilisez deux PMT avec des jeux de filtres avec des passes-bandes à 595/50 (RFP) et 525/50.
    8. Appuyez sur Live Image et modifiez lentement la cellule de pockel pour augmenter la puissance laser sur l’échantillon jusqu’à ce qu’une image soit visible.
    9. Une fois l’image claire obtenue, utilisez le logiciel et la platine motorisée pour définir le haut et le bas d’une pile d’images dans la zone d’échantillonnage souhaitée. Méfiez-vous de la taille du pas et tenez compte du fait que l’axe Z ajuste la profondeur de l’objectif.
    10. Avec l’augmentation de la profondeur, les images deviendront plus sombres. Augmentez lentement le gain pockels/PMT pour garder l’image lumineuse. Veillez à ne pas utiliser trop d’énergie car cela peut entraîner une phototoxicité et des lésions tissulaires.
    11. Définissez un chemin d’enregistrement et démarrez la série Z. Il se déplacera automatiquement vers les positions de départ et d’arrivée en utilisant les paramètres pockel/PMT définis. Une fois la pile terminée, utilisez la lecture pour examiner la qualité de la pile. Une fois l’acquisition des images nécessaires terminée, éteignez le laser Ti-Sapphire.
    12. Déplacez l’animal dans une cage de récupération, comme décrit ci-dessus (étape 3.1).
    13. Quittez la vue Prairie et assurez-vous que toutes les données sont enregistrées/transférées. Éteignez l’ordinateur et tout le matériel.
  2. Post-traitement avec FIDJI
    REMARQUE : Fidji est un logiciel open source axé sur l’analyse d’images biologiques21.
    1. Téléchargez FIJI en ce qui concerne le système d’exploitation. Décompressez le contenu du dossier et exécutez le fichier .exe.
    2. Faites glisser le fichier .env collecté à partir de l’imagerie à deux photons vers la boîte de dialogue. Divisez les canaux en différentes zones d’image. Cela créera deux images différentes avec des canaux différents, l’un contenant le signal de la cellule et l’autre le signal des particules.
    3. Copiez l’une des images et cliquez sur Fichier > Nouveau presse-papiers interne > pour créer une autre image. Renommez l’une des images en Source et l’autre en Copie.
    4. Utilisez l’image de copie et cliquez sur Traiter > Améliorer le contraste dans la boîte de dialogue. Cliquez sur Normaliser et OK , puis sur Traiter > lisser. Cette image est utilisée pour créer un masque et non pour l’analyse. Cliquez sur Image > Ajuster > seuil dans la boîte de dialogue. Utilisez l’échelle mobile et la méthode appropriées pour l’extraction, puis cliquez sur Appliquer.
    5. Utilisez Traiter > Binaire > Éroder pour éroder des pixels individuels en arrière-plan et cliquez sur Traiter > Binaire > Dilater pour rajouter des pixels à l’image.
    6. Cliquez sur Traiter > calculatrice d’image dans la boîte de dialogue, sélectionnez l’image source comme première et sélectionnez la deuxième image comme copie. Utilisez AND pour créer l’intersection des deux images. Répétez la même étape pour l’autre image de canal.
    7. Pour l’analyse du signal en dehors de la région vasculaire, ouvrez une image copiée non modifiée et supprimez la zone vasculaire du signal avec l’outil ROI à main levée.
    8. Définissez les paramètres souhaités en accédant à Analyser > Définir les mesures. Assurez-vous que les options Surface, Densité intégrée et Valeur moyenne de gris sont cochées.
    9. Analysez maintenant par Analyser > mesurer. Une fenêtre avec les mesures apparaîtra. Copiez les données dans une feuille de calcul.
    10. Sélectionnez maintenant une petite zone de l’image qui n’a pas de fluorescence. Ce sera l’arrière-plan.
    11. Cliquez sur Analyser > mesure pour cette région. Copiez des données dans une feuille de calcul.
    12. Enregistrer l’image résultante en tant que fichier > Enregistrer sous > type de fichier Analyser à des fins de remesures ou de publication.

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Résultats

Ici, nous avons effectué une chirurgie de la fenêtre crânienne et greffé des cellules C6 dans un modèle murin NSG de GBM (n = 5). Une bonne étanchéité entre tous les composants impliqués dans la création de la fenêtre (Figure 1A) assurera la durabilité des fenêtres pour l’imagerie à long terme et, en outre, réduira la morbidité. En utilisant la platine adaptée à la 2P-IVM in vivo (Figure 2), nous avons pu imager des animaux sous anesthésie jusqu’à 2 h s...

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Discussion

Nous présentons une méthode de suivi in vivo des NP en temps réel à l’aide de la 2P-IVM à travers une fenêtre crânienne pour évaluer l’administration tumorale de NP d’oxyde de fer marquées par fluorescence. La technique chirurgicale pour cette procédure nécessite une main ferme et des compétences chirurgicales expérimentales avancées. Il est conseillé de s’entraîner à utiliser des carcasses ou des fantômes avant de passer à l’expérience des animaux vivants. Comme alternative, Hoeferlin et al. ont mis en œuvre un...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier le service de microscopie en neurosciences Wu Tsai de Stanford, le Stanford Center for Innovations in Vivo Imaging (SCi3) - centre d’imagerie des petits animaux, la subvention d’instrumentation partagée NIH S10 (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) et le Stanford Preclinical Imaging Facility à Porter Drive pour avoir fourni l’équipement et l’infrastructure nécessaires à ce projet. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Institut national pour la santé de l’enfant et le développement humain, numéro de subvention R01HD103638. Nous tenons à remercier le groupe Schnitzer, l’Université de Stanford ; le laboratoire Zuo, Université de Santa Cruz ; et le Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, Université de Boston, pour des discussions éducatives sur l’imagerie à deux photons et les modèles de fenêtres crâniennes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
solution pour perfusion de chlorure de sodium à 0,9 %Baxter Corp533-JB1301P

Dulbecco’s Modified Eagle Medium		Invitrogen11965-092
Seringues de 1 mLSeringue BD Luer-Lok, REF309628
10 %  ; FBSThermo fisherCytiva SH30910.03HI
10 % DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
Microscope à 2 photonsPrairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
Applicateurs d’alcool, 70 %Medline Industries, LPMDS093810
Alcool, flacon pulvérisateurDecon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
Feuille d’aluminiumReynold BrandsReynold Wrap feuille d’aluminium
Machine d’anesthésiePatterson ScientificSAS3
Surveillance de l’anesthésie  ;Kent Scientific  ;MouseSTAT Jr. Pulsoxymètre
Antibiotique-Antimycosique (100x), liquideInvitrogen15240-096
Applicateurs de bétadineProfessional Disposables International, IncS41125
Poinçon de biopsie, 5 mm  ;MiltexTaille 5
Buprénorphine à libération prolongéeZoo PharmBup SR Lab, 1,0 mg/mLUn médicament générique peut être utilisé à la place.  ;
C6 gliome de rat lignée cellulaireATCC (American Tissue Culture Collection)CCL-107
CanulesBD16 G, 1.1/2 », 30 G, 1 »
CarprofènePfizer  ;Rimadyl, 50 mg/mlUn médicament générique peut être utilisé à la place.
CefazolineSagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/flaconUn médicament générique peut être utilisé à la place.  ;
Crépine à cellules, 40 & micro ; mFisher Scientific87711
Applicateurs à embout en coton, 6"   ;Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
Ciment dentaireStoelting Co51459Kit de ciment dentaire, transparent, 2 composants
DexaméthasoneBimeda138RX, 2 mg/mLUn médicament générique peut être utilisé à la place.  ;
DietGelClearH2ORecovery, 72-06-502
Drapé  ;Cardinal HealthBio Shield Wrap
DrillSaeyang MicrotechEscort Pro, B08350
Pointes de foret  ;Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005Taille 005, US 1/4
FIJI Logicield’analyse d’imagerie National Institute of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/
ForcepsFisher Scientific13-812-41
GazeFisher HealthCareCompresse de gaze de coton stérile, 4 x 4", 22-415-469
Gelfoam  ;Ethicon Inc.  ;Éponge en gélatine résorbable Surgifoam, Réf. 1972
Germinator  ;Cellpoint Scientific  ;Germinator 500, n° 11688
Lamelles en verre, 5 mm de diamètreFisher ScientificMenzel Cover glass  ;
Gants, non stérilesFisher Scientificd’examen médical en nitrile non poudrés
Gants stérilesMedline Industries, LPMDS104070
Crème dépilatoireChurch & DwightNair Lotion décapante  ;
Seringue HamiltonHamilton Company IncGastight #1701, 10 & micro ;
HBSS sans Ca, Mg FisherScientificPI88284
Barre de têteHongwayDiamètre intérieur de 5 mm Joints
Coussin chauffantStoelting Co.Chauffe-rongeurs X2
Seringues à insulineExel International Medical Products  ;29G x 1/2&Prime ;
Nanoparticules d’oxyde de ferCovis Pharma GmbHFeraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
IsofluraneDechra26675-46-7
SourisJackson LaboratoriesNSG, Strain 005557
Microscope (chirurgie)SeilerMedical Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticulessur mesureNanoparticules d’oxyde de fer (Ferumoxytol) marquées à la fluorescéine isothiocyanate
Pommade ophtalmiquePrincipaux produits pharmaceutiquesLubrifresh P.M. pommade de nuit, 203964
OxygenLinde Gas & Équipement Inc.  ;Cylindre en acier haute pression de style K, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Gobelets en plastiqueGeorgia-Pacirif Consumer ProductsDixie Portion Cup, 2 oz., Plastique, Transparent, PK2400
Tube en polyéthylèneBraintree Scientific50-195-5494
ÉchelleOhaus CorpCR2200
ScalpelIntegra Life Sciences Production CorpIntegra Miltex Scalpel
CiseauxFisher Scientific13-804-18
ScellantHenkel CorpLoctite 4014
Blouse de laboratoire à usage uniqueHigh Tech Conversions17-444-081
Cadre stéréotaxiqueStoelting Co.  ;Stoelting New Standard TM
Systèmes de filtration par le haut des bouteilles stérilesFisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma NO. :S2GPU05RE
Boîte en polystyrèneN/AN/A
Gants chirurgicaux CardinalHealth19-163-108
Colle chirurgicale, adhésif pour tissus 3M Vetbond3M Animal Care Prodcuts1469SB
Tail cathéter veineuxCustomSe compose de deux canules de 30 G reliées à un tube en sillicone  ;
TrypLE Express (1x), sans rouge phénolInvitrogen12604-039
Torche ultravioletteTechnologie d’ensoleillement printanierConsciot
antiadhésivepour rongeurs Gants Ltoriquesjetable en acier inoxydable

Références

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970(2021).
  3. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).
  4. Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).
  5. Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).
  6. Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).
  7. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694(2017).
  8. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
  9. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
  10. Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
  11. Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
  12. Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276(2014).
  13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
  14. Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381(2016).
  15. Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).
  16. Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
  17. Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556(2021).
  18. Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
  19. Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
  20. Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188(2022).
  23. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818(2016).
  25. Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
  26. Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678(2021).
  27. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  28. Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
  29. Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
  30. Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
  31. Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972(2008).
  32. Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
  33. Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234(2021).

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