Detta protokoll introducerar de verktyg som finns tillgängliga för modellering av småmolekylära ligander i kryoEM-kartor av makromolekyler.
Att dechiffrera protein-ligandinteraktionerna i ett makromolekylärt komplex är avgörande för att förstå den molekylära mekanismen, underliggande biologiska processer och läkemedelsutveckling. Under de senaste åren har kryogen provelektronmikroskopi (cryoEM) dykt upp som en kraftfull teknik för att bestämma makromolekylers strukturer och för att undersöka sättet för ligandbindning vid nära atomär upplösning. Att identifiera och modellera icke-proteinmolekyler i cryoEM-kartor är ofta utmanande på grund av anisotrop upplösning över molekylen av intresse och inneboende brus i data. I den här artikeln introduceras läsarna till olika programvaror och metoder som för närvarande används för ligandidentifiering, modellbygge och förfining av atomkoordinater med hjälp av utvalda makromolekyler. Ett av de enklaste sätten att identifiera närvaron av en ligand, som illustreras med enolasenzymet, är att subtrahera de två kartorna som erhållits med och utan liganden. Den extra densiteten hos liganden kommer sannolikt att sticka ut i skillnadskartan även vid ett högre tröskelvärde. Det finns fall, som visas i fallet med metabotropisk glutamatreceptor mGlu5, då sådana enkla differenskartor inte kan genereras. Den nyligen introducerade metoden för att härleda Fo-Fc utelämna-kartan kan fungera som ett verktyg för att validera och demonstrera närvaron av liganden. Slutligen, med det välstuderade β-galaktosidaset som exempel, analyseras effekten av upplösning på modellering av ligander och lösningsmedelsmolekyler i cryoEM-kartor, och en utblick över hur cryoEM kan användas i läkemedelsutveckling presenteras.
Celler utför sina funktioner genom att utföra otaliga kemiska reaktioner samtidigt och oberoende, var och en noggrant reglerad för att säkerställa deras överlevnad och anpassningsförmåga som svar på miljösignaler. Detta uppnås genom molekylär igenkänning, vilket gör det möjligt för biomolekyler, särskilt proteiner, att bilda transienta eller stabila komplex med andra makromolekyler såväl som små molekyler eller ligander1. Således är protein-ligandinteraktioner grundläggande för alla processer inom biologin, som inkluderar reglering av proteinuttryck och aktivitet, igenkänning av substrat och kofaktorer av enzymer, samt hur celler uppfattar och vidarebefordrar signaler 1,2. En bättre förståelse av de kinetiska, termodynamiska och strukturella egenskaperna hos protein-ligandkomplexet avslöjar den molekylära grunden för ligandinteraktion och underlättar också rationell läkemedelsdesign genom att optimera läkemedelsinteraktion och specificitet. Ett ekonomiskt och snabbare tillvägagångssätt för att studera protein-ligandinteraktion är att använda molekylär dockning, vilket är en beräkningsmetod som virtuellt screenar ett brett spektrum av små molekyler och förutsäger bindningssättet och affiniteten hos dessa ligander till målproteiner3. Experimentella bevis från högupplösta strukturer bestämda med röntgendiffraktion (XRD), kärnmagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) ger dock det väsentliga beviset för sådana förutsägelser och hjälper till att utveckla nyare och mer effektiva aktivatorer eller hämmare för ett givet mål. I den här artikeln används förkortningen “cryoEM” som tekniken ofta kallas. Det pågår dock en debatt om att välja rätt nomenklatur, och nyligen har termen kryo-genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) föreslagits för att indikera att provet har kryogen temperatur och avbildas med elektroner4. På samma sätt har kartorna som härrör från cryoEM kallats elektronpotential, elektrostatisk potential eller Coulombpotential, och för enkelhetens skull använder vi här cryoEM-kartor 5,6,7,8,9,10.
Även om XRD har varit den gyllene standardtekniken inom högupplöst strukturbestämning av protein-ligandkomplex, har kryoEM efter upplösningsrevolutionen11 tagit fart, vilket indikeras av ökningen av Coulomb-potentialkartor eller kryoEM-kartor som deponerats i elektronmikroskopidatabasen (EMDB)12,13 under de senaste åren14. På grund av framsteg inom provberedning, avbildning och databehandlingsmetoder ökade antalet Protein Data Bank (PDB)14-depositioner som använder kryoEM från 0,7 % till 17 % mellan 2010 och 2020, med cirka 50 % av rapporterade strukturer 2020 som bestämdes till 3,5 Å upplösning eller bättre15,16. CryoEM har snabbt antagits av strukturbiologin, inklusive läkemedelsindustrin, eftersom det möjliggör studier av flexibla och icke-kristallina biologiska makromolekyler, särskilt membranproteiner och multiproteinkomplex, med nästan atomär upplösning, vilket övervinner kristallisationsprocessen och erhåller väl diffrakterande kristaller som krävs för högupplöst strukturbestämning med XRD.
Noggrann modellering av liganden i cryoEM-kartan är av största vikt, eftersom den fungerar som en ritning av protein-ligandkomplexet på molekylär nivå. Det finns flera automatiserade ligandbyggande verktyg som används inom röntgenkristallografi som beror på formen och topologin för liganddensiteten för att passa eller bygga in liganden i elektrondensiteten 17,18,19,20. Icke desto mindre, om upplösningen är lägre än 3 Å, tenderar dessa metoder att ge mindre önskvärda resultat eftersom de topologiska egenskaper som de är beroende av för igenkänning och uppbyggnad blir mindre definierade. I många fall har dessa metoder visat sig vara ineffektiva när det gäller att exakt modellera ligander till kryoEM-kartor, eftersom dessa kartor har bestämts i intervallet låg till medelhög upplösning, vanligtvis mellan 3,5 Å-5 Å17.
Det första steget i 3D-strukturbestämning av ett protein-ligandkomplex med cryoEM innebär att antingen samrena liganden med proteinet (när liganden har en hög bindningsaffinitet till proteinet) eller inkubera proteinlösningen med liganden under en viss tid innan rutnätsberedning. Därefter placeras en liten provvolym på ett plasmarengjort håligt TEM-galler, följt av snabbfrysning i flytande etan och slutligen avbildning med en kryo-TEM. 2D-projektionsbilderna från hundratusentals till miljontals enskilda partiklar beräknas som medelvärden för att rekonstruera en 3-dimensionell (3D) Coulomb-potentialkarta över makromolekylen. Att identifiera och modellera ligander och lösningsmedelsmolekyler i dessa kartor innebär betydande utmaningar i många fall på grund av den anisotropa upplösningen över kartan (dvs. upplösningen är inte enhetlig över makromolekylen), flexibiliteten i regionen där liganden är bunden och bruset i data. Många av de modellerings-, förfinings- och visualiseringsverktyg som utvecklades för XRD anpassas nu för användning i cryoEM för samma ändamål 18,19,20,21. I den här artikeln presenteras en översikt över olika metoder och programvara som för närvarande används för att identifiera ligander, bygga modeller och förfina koordinaterna som härrör från cryoEM. Ett steg-för-steg-protokoll har tillhandahållits för att illustrera de processer som är involverade i modellering av ligander med hjälp av specifika protein-ligandkomplex med varierande upplösning och komplexitet.
Det första steget i modellering av ligander i kryoEM-kartor inkluderar identifiering av ligandens densitet (icke-protein) i kartan. Om ligandbindning inte inducerar någon konformationsförändring i proteinet, framhäver beräkningen av en enkel skillnadskarta mellan protein-ligandkomplexet och apo-proteinet i huvudsak regionerna med extra densitet, vilket tyder på närvaron av liganden. Sådana skillnader kan observeras omedelbart, eftersom det bara krävs två kartor, och till och med mellanliggande kartor under processen med 3D-förfining kan användas för att kontrollera om liganden är närvarande. Dessutom, om upplösningen är tillräckligt hög (<3,0 Å), kan differenskartan också ge insikter om platsen för vattenmolekyler samt joner som interagerar med liganden och proteinresterna.
I avsaknad av apo-proteinkartan är det nu möjligt att använda Servalcat22, som är tillgängligt som ett fristående verktyg och som också har integrerats i CCP-EM-mjukvarusviten23,24 som en del av Refmac-förfiningen och i CCP4 8.0 release25,26. Servalcat gör det möjligt att beräkna en FSC-viktad differenskarta (Fo-Fc) med hjälp av de oskarpa halvavbildningarna och apoproteinmodellen som indata. Den utelämnade Fo-Fc-kartan representerar skillnaden mellan den experimentella kartan (Fo) och kartan som härleds från modellen (Fc). I frånvaro av en ligand i modellen tyder en positiv densitet i en Fo-Fc-karta som överlappar med den experimentella EM-kartan vanligtvis på närvaron av liganden. Antagandet här är att proteinkedjan är väl anpassad på kartan, och den återstående positiva densiteten indikerar platsen för liganden. Det är dock viktigt att noggrant undersöka om den positiva densiteten härrör från modelleringsfelaktigheter, till exempel fel rotamer av en proteinsidokedja.
Det andra steget innebär att erhålla eller skapa en kartesisk koordinatfil av liganden med väldefinierad geometri från den tillgängliga kemiska informationen. Standardligander (till exempel ATP och NADP+) som redan finns tillgängliga i CCP4-monomerbiblioteket kan användas för förfining genom att hämta koordinat- och geometrifilerna via deras monomeranslutningskod. För okända eller icke-standardiserade ligander finns dock olika verktyg tillgängliga för att skapa geometrifilerna. Några av exemplen är eLBOW27 – (electronic ligand builder and optimization workbench) i Phenix28, Lidia – ett inbyggt verktyg i Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep 32-a-modulen av Glide inom Schrödinger-sviten. Ligandkoordinatfilen passas sedan in i densiteten, styrd av både den experimentella cryoEM-kartan och differenskartan i Coot. Detta följs av real-space refinement i Phenix28 eller reciprok refining i Refmac33. En Linux-arbetsstation eller en bärbar dator utrustad med ett bra grafikkort och ovan nämnda programvara krävs. De flesta av dessa program ingår i olika sviter. CCP-EM24 och Phenix28 är fritt tillgängliga för akademiska användare och inkluderar en mängd olika verktyg som används i den här artikeln, inklusive Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. På samma sätt ger Chimera37 och ChimeraX38 gratis licenser till akademiska användare.
Förbättringarna i hårdvara och mjukvara för mikroskop har resulterat i en ökning av antalet kryoEM-strukturer under de senaste åren. Även om den högsta upplösningen som för närvarande uppnås i kryoEM med en partikel är 1,2 Å 57,58,59, bestäms majoriteten av strukturerna runt 3-4 Å upplösning. Modellering av ligander i kartor med medelhög till låg upplösning kan vara knepigt och ofta fyllt av tvetydighet. Med …
The authors have nothing to disclose.
SJ är mottagare av doktorandtjänsten från DAE-TIFR, och finansieringen är erkänd. KRV erkänner DBT B-Life-anslaget DBT/PR12422/MED/31/287/2014 och stödet från Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikationsnummer. RTI4006.
CCP4-8.0 | Consortium of several institutes | https://www.ccp4.ac.uk | Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography |
CCP-EM | Consortium of several institutes | https://www.ccpem.ac.uk/download.php | Free for academic users and includes Coot, Relion and many others |
Coot | Paul Emsley, LMB, Cambridge | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | General software for model building but also available with other suites described above |
DockinMap (Phenix) | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html | Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps |
Electron Microscopy Data Bank | Consortium of several institutes | https://www.ebi.ac.uk/emdb/ | Public Repository for Electron Microscopy maps |
Falcon | Thermo Fisher Scientific | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf | Commercial, camera from Thermo Fisher |
Phenix | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/download | Free for academic users and includes Coot |
Protein Data Bank | Consortium of several institutes | https://rcsb.org | Public database of macromolecular structures |
Pymol | Schrodinger | https://pymol.org/2/ | Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee. |
Relion | MRC-LMB, Cambridge | https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html | Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM |
Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE |
Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher |
UCSF Chimera | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html | General purpose software for display, analysis and more |
UCSF Chimera X | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ | General purpose software for display, analysis and more |