Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع الشيغيلة

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي مقايسات العدوى لاستجواب الالتزام بالشيغيلا والغزو والتكاثر داخل الخلايا باستخدام خطوط الخلايا الظهارية في المختبر .

Abstract

يسبب العامل الممرض البكتيري المعوي المتكيف مع الإنسان Shigella ملايين الإصابات كل عام ، ويخلق تأثيرات نمو طويلة الأجل بين مرضى الأطفال ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم. تسبب العدوى الإسهال المائي أو الدموي نتيجة لعبور العامل الممرض للجهاز الهضمي وإصابة الخلايا الظهارية المبطنة للقولون. مع الزيادات المذهلة في مقاومة المضادات الحيوية والنقص الحالي في اللقاحات المعتمدة ، تعد بروتوكولات البحث الموحدة ضرورية لدراسة هذا العامل الممرض الهائل. هنا ، يتم تقديم منهجيات لفحص التسبب الجزيئي للشيغيلا باستخدام التحليلات المختبرية للالتصاق البكتيري والغزو والتكاثر داخل الخلايا في الخلايا الظهارية القولونية. قبل تحليلات العدوى ، تم التحقق من النمط الظاهري للضراوة لمستعمرات الشيغيلا من خلال امتصاص صبغة الكونغو الحمراء على ألواح الآجار. يمكن أيضا اعتبار الوسائط المختبرية المكملة أثناء الزراعة البكتيرية لتقليد الظروف في الجسم الحي . ثم تستخدم الخلايا البكتيرية في بروتوكول موحد لإصابة الخلايا الظهارية القولونية في لوحات زراعة الأنسجة في تعدد ثابت من العدوى مع التكيفات لتحليل كل مرحلة من مراحل العدوى. لمقايسات الالتصاق ، يتم تحضين خلايا الشيغيلا بمستويات وسائط منخفضة لتعزيز الاتصال البكتيري بالخلايا الظهارية. لكل من مقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، يتم تطبيق الجنتاميسين لفترات زمنية مختلفة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية وتمكين تقييم الغزو و / أو القياس الكمي لمعدلات النسخ المتماثل داخل الخلايا. تعدد جميع بروتوكولات العدوى البكتيريا الملتصقة و / أو الغازية و / أو داخل الخلايا عن طريق التخفيف المتسلسل لمحللات الخلايا الظهارية المصابة وطلاء وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية المتعلقة بإصابة التتر على ألواح أجار الكونغو الحمراء. تتيح هذه البروتوكولات معا توصيفا ومقارنات مستقلة لكل مرحلة من مراحل عدوى الشيغيلة للخلايا الظهارية لدراسة هذا العامل الممرض بنجاح.

Introduction

تشكل أمراض الإسهال التي تسببها مسببات الأمراض البكتيرية المعوية عبئا صحيا عالميا كبيرا. في عام 2016 ، كانت أمراض الإسهال مسؤولة عن 1.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم وكانت السبب الرئيسي الرابع للوفاة بين الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات من سن 1,2. الممرض البكتيري المعوي سلبي الجرام Shigella هو العامل المسبب لداء الشيغيلات ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم3. يسبب داء الشيغيلات معدلات اعتلال ووفيات كبيرة كل عام لدى الأطفال من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل 4,5 ، بينما ترتبط العدوى في البلدان المرتفعة الدخل بمراكز الرعاية النهارية ، والأمراض المنقولة بالأغذية ، والفاشيات المنقولة بالمياه6،7،8،9. أدى تطوير لقاحغير فعال 10 وارتفاع معدلات مقاومة مضادات الميكروبات (AMR)11,12 إلى تعقيد إدارة فاشيات الشيغيلا على نطاق واسع. تظهر بيانات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها الحديثة أن ما يقرب من 46٪ من إصابات الشيغيلا في الولايات المتحدة أظهرت مقاومة للأدوية في عام 202013,14 ، بينما أعلنت منظمة الصحة العالمية أن الشيغيلة من مسببات الأمراض ذات الأولوية في مقاومة مضادات الميكروبات والتي تحتاج إلى علاجات جديدةبشكل عاجل 15.

تنتقل عدوى الشيغيلا بسهولة عن طريق البراز الفموي عند تناول طعام أو ماء ملوث ، أو من خلال الاتصال البشري المباشر. تطورت الشيغيلا لتصبح ممرضة فعالة ومتكيفة مع الإنسان ، مع جرعة معدية من 10-100 بكتيريا كافية للتسبب في المرض16. أثناء العبور المعوي الصغير ، تتعرض الشيغيلة لإشارات بيئية ، مثل ارتفاع درجة الحرارة والصفراء17. يؤدي اكتشاف هذه الإشارات إلى تغييرات نسخية للتعبير عن عوامل الفوعة التي تعزز قدرة البكتيريا على إصابة القولون البشري17،18،19. لا تغزو الشيغيلة ظهارة القولون من السطح القمي ، بل تنتقل عبر الطبقة الظهارية بعد الامتصاص إلى خلايا ميكروطية متخصصة تقدم المستضد (خلايا M) داخل الظهارة المرتبطة بالجريب20،21،22. بعد انتقال الخلايا ، يتم البلعمة خلايا الشيغيلة بواسطة الضامة المقيمة. تهرب الشيغيلة بسرعة من البلعمة وتؤدي إلى موت خلايا البلاعم ، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات5،23،24. ثم تغزو الشيغيلة الخلايا الظهارية القولونية من الجانب القاعدي ، وتحلل الفجوة العصارية الكبيرة ، وتنشئ مكانا متماثلا في السيتوبلازم 5,25. تقوم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وخاصة إنترلوكين -8 (IL-8) ، بتجنيد كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال النووية (PMNs) إلى موقع العدوى ، مما يضعف الوصلات الضيقة الظهارية ، ويمكن من تسلل البكتيريا للبطانة الظهارية إلى تفاقم العدوى القاعدية5. تدمر PMNs البطانة الظهارية المصابة لاحتواء العدوى ، مما يؤدي إلى الأعراض المميزة للزحار العصوي (الدموي)5. على الرغم من أن آليات الغزو والتكاثر داخل الخلايا قد تم توصيفها بدقة ، إلا أن الأبحاث الجديدة تظهر مفاهيم جديدة مهمة في عدوى الشيغيلا ، بما في ذلك تنظيم الفوعة أثناء عبور الجهاز الهضمي (GI)17 ، والالتزام19 ، وتحسين الوصول القاعدي الجانبي من خلال نفاذية الحاجز26 ، والنقل بدون أعراض في الأطفال الذين يعانون من سوء التغذية27.

تقتصر قدرة الشيغيلة على التسبب في مرض الإسهال على البشر والرئيسيات غير البشرية (NHP)28. تم تطوير نماذج عدوى الشيغيلا المعوية لسمك الزرد29 والفئران30 وخنازير غينيا31 والأرانب21،32،33 والخنازير34،35. ومع ذلك ، لا يمكن لأي من هذه الأنظمة النموذجية تكرار خصائص المرض التي لوحظت أثناء العدوى البشريةبدقة 36. على الرغم من إنشاء نماذج NHP لداء الشيغيلات لدراسة التسبب في الشيغيلة ، إلا أن هذه الأنظمة النموذجية مكلفة في التنفيذ وتتطلب جرعات معدية عالية بشكل مصطنع ، تصل إلى تسعة أوامر من حيث الحجم أعلى من الجرعة المعدية للبشر37،38،39،40،41،42. وبالتالي ، فإن التكيف الملحوظ للشيغيلا لعدوى المضيفين البشريين يستلزم استخدام مزارع الخلايا المشتقة من الإنسان لإعادة إنشاء نماذج ذات صلة من الناحية الفسيولوجية للاستجواب الدقيق لتسبب الشيغيلا.

هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لقياس معدلات الالتزام بالشيغيلة وغزوها وتكرارها داخل الخلايا الظهارية القولونية HT-29. باستخدام هذه البروتوكولات الموحدة ، يمكن استجواب الآليات الجزيئية التي تؤثر بها جينات الفوعة البكتيرية والإشارات البيئية على كل خطوة من خطوات عدوى الشيغيلا لفهم علاقة التفاعل الديناميكية بين المضيف والممرض بشكل أفضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير الكواشف والمواد

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

  1. وسط TSB: أضف 0.5 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI) إلى 15 جم من مرق الصويا التربتيك (TSB ، انظر جدول المواد) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  2. وسط الأملاح الصفراوية (TSB + BS): لتحضير مكتب تقييس الاتصالات الذي يحتوي على 0,4٪ (وزن/حجم) من الأملاح الصفراوية، أعد تعليق 0,06 غرام من الأملاح الصفراوية (BS، انظر جدول المواد) في 15 مل من TSB المعقم. تعقيم المرشح باستخدام مرشح PES 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: تتكون الأملاح الصفراوية من خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديوم. قم بإعداد وسائط جديدة مباشرة قبل الاستخدام.
  3. DMEM + 10٪ (v / v) FBS: أضف 5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) إلى 45 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  4. DMEM + جنتاميسين: إلى أنبوب 50 مل ، أضف 50 مل من DMEM و 50 ميكرولتر من 50 مجم / مل جنتاميسين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: اصنع قسمة طازجة ودافئة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل كل تجربة.
  5. PBS + 1٪ (v / v) Triton X-100: أضف 150 ميكرولتر من Triton X-100 إلى 15 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: اصنع قسمة طازجة ودافئة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل كل تجربة.
  6. لوحات مؤشر TSB + Congo الحمراء: أضف 15 غراما من TSB و7,5 غراما من أجار محدد و0.125 غراما من صبغة الكونغو الحمراء (انظر جدول المواد) إلى زجاجة سعة 1 لتر. أضف 0.5 لتر من ماء DI والأوتوكلاف. صب 10-20 مل من الوسائط في أطباق بتري المعقمة الفردية (100 مم × 15 مم) واتركها تتصلب.
    تنبيه: الكونغو الأحمر مادة مسرطنة وسامة تناسلية. تأكد من أن التعامل مع الكونغو الأحمر يتم باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. راجع ورقة بيانات سلامة المنتج للحصول على معلومات إضافية.
    ملاحظة: ما يقرب من 20 لوحة مصنوعة من وسائط الكونغو الحمراء سعة 0.5 لتر. يمكن تحضير الألواح قبل 2-3 أيام وتركها مقلوبة في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. للتخزين طويل الأجل ، ضع الألواح المقلوبة في أكمام بلاستيكية عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  7. DMEM + 10٪ (v / v) FBS و 5٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO): أضف 42.5 مل من DMEM و 5 مل من FBS و 2.5 مل من DMSO إلى أنبوب 50 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.

2. إعداد البكتيريا

ملاحظة: جميع بروتوكولات زراعة وتخزين مختبر الشيغيلا مقتبسة من Payne، S. M.43.

تنبيه: الشيغيلة spp. هي مسببات الأمراض من مجموعة المخاطر2 44. أداء جميع الأعمال المختبرية في بيئة BSL-2 ، مع اتخاذ تدابير أمان إضافية للحد من التعرض العرضي بسبب الجرعة المعدية المنخفضة من Shigella spp.

  1. نمو الشيغيلا من المخزونات المجمدة
    1. انقل كمية صغيرة من المستنبتة المجمدة من القارورة المبردة إلى صفيحة أجار حمراء TSB + Congo باستخدام قضيب معقم.
    2. اللهب تعقيم حلقة التلقيح والسماح لها لتبرد. خط اللقاح ذهابا وإيابا عبر ربع واحد من اللوحة. قم بإشعال الحلقة ، واتركها لتبرد ، ثم خط من الربع الأول إلى الربع الثاني من اللوحة. كرر لخط اللقاح في الربعين الثالث والرابع من اللوحة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بخط اللقاح باستخدام قضيب معقم جديد بين كل ربع.
    3. اقلب اللوحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: الحضانة عند درجات حرارة ≥37 درجة مئوية مطلوبة للتعبير عن عوامل ضراوة الشيغيلا اللازمة لمراقبة النمط الظاهري45 الإيجابي لحمى الكونغو (CR +). سيكون للمستعمرات Avirulent مظهر أبيض ولن تكون غازية.
    4. أغلق الطبق بغشاء البارافين واحفظه في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ستبقى المستعمرات البكتيرية قابلة للحياة على ألواح أجار لمدة 1-2 أسابيع.
  2. نمو الشيغيلا بين عشية وضحاها في الثقافة السائلة
    1. قسمة 3 مل من وسائط مكتب تقييس الاتصالات في أنابيب استزراع معقمة سعة 14 مل.
    2. اختر مستعمرة حمراء واحدة معزولة جيدا (CR +) باستخدام قضيب معقم وأعد تعليقها في الوسائط السائلة.
    3. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة (rpm).

3. إعداد خلايا حقيقية النواة HT-29

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار. تم الحصول على خطوط خلايا HT-29 من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC). تم تكييف بروتوكولات الصيانة HT-29 من توصيات ATCC46. يجب تسخين جميع الوسائط مسبقا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يجب تنفيذ جميع بروتوكولات الصيانة HT-29 في خزانة السلامة البيولوجية. الامتناع عن إنتاج فقاعات عند الخلط / العمل مع خلايا HT-29 في الوسائط لتجنب التغيرات الدراماتيكية في درجة الحموضة.

  1. إذابة خلايا HT-29 من المخزون المجمد
    1. قم بإذابة قارورة خلايا HT-29 في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من بقاء الغطاء فوق الماء بالكامل لتجنب التلوث. يجب أن يستغرق ذوبان الجليد أقل من 2 دقيقة.
    2. قم بإزالة القارورة من الماء فور إذابة المزرعة بالكامل وتطهيرها بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة باستخدام تقنيات التعقيم.
    3. أضف جميع محتويات القارورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من DMEM + 10٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. صب المادة الطافية في حاوية نفايات وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM الدافئ + 10٪ FBS. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق زراعة الأنسجة 75 سم2 (T75) يحتوي على 10 مل من DMEM الدافئ + 10٪ FBS (الحجم الإجمالي 20 مل).
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ (حوالي 6-7 أيام).
      ملاحظة: يتم تقدير الالتقاء من خلال التقريب البصري.
  2. بذر خلايا HT-29
    1. قم بالتسخين المسبق 20 مل من PBS و 50 مل من DMEM + 10٪ FBS في حمام مائي 37 درجة مئوية و 3 مل من 0.25٪ (وزن / حجم) Trypsin-EDTA إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. بمجرد أن تصل خلايا HT-29 (من الخطوة 3.1) إلى التقاء 90٪ ، صب وسائط زراعة الخلايا HT-29 من قارورة T75 في حاوية نفايات. صب ~ 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ في القارورة وحركه برفق لغسله. صب برنامج تلفزيوني في حاوية نفايات. تغسل مع برنامج تلفزيوني دافئ مرة أخرى وصب.
    3. أضف 2-3 مل من 0.25٪ (وزن / حجم) Trypsin-EDTA وقم بتدوير بلطف عبر مساحة السطح بأكملها. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 دقائق.
    4. قم بإزالة القارورة من الحاضنة وقم بتدوير Trypsin-EDTA برفق ، مما يضمن بصريا فصل جميع الخلايا عن السطح.
    5. أضف على الفور 6 مل من DMEM الدافئ + 10٪ FBS لإلغاء تنشيط التربسين. ماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا.
    6. انقل جميع المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدويره عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. صب المادة الطافية برفق في حاوية نفايات وأعد تعليق الحبيبات في 6 مل من DMEM الدافئ + 10٪ FBS.
    8. مباشرة بعد التعليق ، انقل 10 ميكرولتر من خلايا HT-29 المعلقة من منتصف المزرعة إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل. أضف 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل واخلطها.
    9. أضف 10 ميكرولتر من خلية HT-29 / مزيج Trypan الأزرق إلى شريحة غرفة عداد خلايا الكونتيسة التي يمكن التخلص منها (انظر جدول المواد). تعداد عدد الخلايا الحية وحساب صلاحية الخلية.
      ملاحظة: عند توثيق عدد الخلايا في العينة، اقرأ الرقم الموجود أسفل عدد الخلايا "الحية"، وليس إجمالي عدد الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تعداد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم.
    10. البذور المعاد تعليقها خلايا HT-29 في قارورة T75 جديدة أو لوحة 6 آبار.
      1. لقارورة T75:
        1. ماصة بلطف لخلط ، ثم نقل 2.5 × 106 خلايا إلى قارورة T75 جديدة وفقا للمعادلة أدناه:
          Equation 1
        2. أضف وسائط DMEM الدافئة + 10٪ FBS إلى حجم نهائي يبلغ 20 مل (التركيز النهائي 1.25 × 105 خلايا / مل).
        3. قم بتفريق الخلايا بالتساوي عبر القارورة عن طريق التأرجح برفق ذهابا وإيابا.
        4. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
          ملاحظة: لتحقيق النمو الأمثل ، استبدل وسائط DMEM + 10٪ FBS في دورق T75 كل ~ 3 أيام. صب الوسائط في حاوية نفايات وأضف 10 مل من PBS الدافئ إلى القارورة. قم بتدوير PBS برفق وصبه في حاوية النفايات. ثم أضف 20 مل من DMEM الطازج والدافئ + 10٪ FBS إلى القارورة والعودةإلى حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪.
      2. للوحة 6 آبار:
        1. ماصة بلطف لخلط ، ثم نقل 5.85 × 106 خلايا إلى أنبوب مخروطي جديد 50 مل وفقا للمعادلة أدناه:
          Equation 2
        2. أضف وسائط DMEM + 10٪ FBS إلى حجم نهائي يبلغ 26 مل (التركيز النهائي 2.25 × 105 خلايا / مل).
        3. ماصة لخلط بلطف ، ثم الاستغناء عن 2 مل (4.5 × 105 خلايا) في آبار فردية من ألواح 6 آبار.
        4. قم بتفريق الخلايا بالتساوي عبر البئر عن طريق التأرجح برفق لأعلى / لأسفل ولليسار / لليمين 2-3x.
        5. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -95٪ (حوالي 3-4 أيام).
          ملاحظة: يوصى بالتقاء 85٪ لمقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، بينما يوصى بالتقاء 90٪ -95٪ لمقايسات الالتزام. يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء ~ 85٪ بعد حضانة 48 ساعة بتركيز نهائي يبلغ حوالي 1 × 106 خلايا / بئر. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على عدد الخلايا المصنفة وطول الحضانة.
  3. صنع مخزون HT-29 المجمد
    1. القسمة 1 مل من DMEM + 10٪ FBS + 5٪ وسائط DMSO في قوارير مبردة فردية.
    2. أضف 1 × 106 خلايا HT-29 من الخطوة 3.2.7 إلى كل قارورة. احسب حجم الخلايا وفقا للصيغة أدناه:
      Equation 3
    3. قم بتخزين خلايا HT-29 على المدى الطويل تحت -130 درجة مئوية في مجمد تخزين بخار النيتروجين السائل.

4. مقايسة الالتزام

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

  1. الثقافة الفرعية بين عشية وضحاها ثقافات الشيغيلا عبر التخفيف 1:50 إلى وسائط جديدة.
    1. دوامة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من كل مزرعة ليلية إلى 5 مل من TSB أو TSB + BS الطازج في أنبوب استزراع بحجم مناسب.
      ملاحظة: الحد من حجم الثقافة إلى <20٪ من دورق الثقافة أو حجم الأنبوب لضمان التهوية المناسبة.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلى كثافة بصرية (OD600) تبلغ 0.7 (مرحلة منتصف اللوغاريتم من نمو الشيغيلا ) ؛ حوالي 2-2.5 ساعة.
      ملاحظة: خلال الاستزراع الفرعي ، قسمة 50 مل من DMEM وحجم كاف من PBS لجميع خطوات الغسيل ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. اترك الوسائط تصل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. نقل 2 × 108 وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) الشيغيلة المستزرعة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 2 مل.
    ملاحظة: 2 × 108 CFUs يتوافق مع حوالي 1 مل من الخلايا البكتيرية عند OD600 من 0.7. استخدم قراءات OD600 لتقريب CFU / mL وفقا لمعايرة كل مقياس طيف ضوئي فردي.
  3. اغسل كل عينة من الشيغيلا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني.
    1. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ وأعد تعليق الحبيبات جيدا ، وقم بسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح الخليط متجانسا تماما (8-10x).
    2. كرر الخطوة 4.3.1 1x وقت إضافي.
    3. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، ونضح المادة الطافية ، وإعادة تعليق الكريات في 2 مل من DMEM الدافئ.
      ملاحظة: سيكون التركيز النهائي للبكتيريا المعلقة 1 × 108 CFU / مل.
  4. دوامة ، ثم أضف 1 مل (1 × 108 CFUs) من الشيغيلة المعاد تعليقها إلى كل بئر من الطبقات الظهارية القولونية HT-29 المحضرة في ألواح ذات 6 آبار (من الخطوة 3.2.10.2).
    ملاحظة: يتم إجراء العدوى عادة عند تعدد العدوى (MOI ؛ نسبة الخلايا البكتيرية إلى الخلايا الظهارية) من 100. لاختبار MOIs المختلفة ، قم بتخفيف الشيغيلة المعاد تعليقها في DMEM الدافئ إلى التركيز المطلوب ، ثم أضف 1 مل من البكتيريا المخففة إلى طبقة HT-29 أحادية. على سبيل المثال ، لاختبار MOI من 10 ، قم بتخفيف البكتيريا 1:10 بإضافة 150 ميكرولتر من 1 × 108 CFU / mL بكتيريا إلى 1.35 مل من DMEM الدافئ ، ثم ضع 1 مل (1 × 107 CFUs) على خلايا HT-29.
  5. احتضان الألواح المكونة من 6 آبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات.
  6. أثناء الحضانة ، حدد عيار العدوى البكتيرية.
    1. تحضير التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف لخلايا الشيغيلا المعاد تعليقها (من الخطوة 4.3.3) إلى برنامج تلفزيوني.
    2. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 على لوحات TSB + الكونغو الحمراء واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي قدره 1 × 10-6 و 1 × 10-7 ، على التوالي.
  7. بعد الحضانة ، اغسل الطبقات الأحادية 4-5x باستخدام برنامج تلفزيوني.
    1. نضح الوسائط من كل بئر.
      ملاحظة: عند شفط الوسائط من ألواح ذات 6 آبار ، قم بتوجيه طرف الشافطة على طول الجانب السفلي من الآبار ، في محاولة لتجنب ملامسة خلايا HT-29.
    2. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر واغسله بلطف.
      ملاحظة: لغسل 6 طبقات أحادية اللون برفق باستخدام PBS ، حرك اللوحة لأعلى ولأسفل ومن جانب إلى آخر على سطح الطاولة. يمكن أن يؤدي غسل الألواح بحركة دائرية و / أو إزالة اللوحة من سطح الطاولة إلى الإزالة الميكانيكية للخلايا من البلاستيك.
    3. كرر الخطوتين 4.7.1 و 4.7.2 4 مرات إضافية.
  8. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط وتحلل خلايا HT-29 بإضافة 1 مل من PBS + 1٪ Triton X-100 إلى كل بئر.
  9. احتضان 6 أطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. استخدم مكشطة خلية أو طرف ماصة منحني لكشط الخلايا المحللة من قاع البئر ونقل 1 مل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل.
  11. تحديد عدد البكتيريا المرتبطة بالخلايا.
    1. دوامة كل أنبوب (من الخطوة 4.10) لمدة 30 ثانية على الأقل لإزاحة الشيغيلة من الخلايا حقيقية النواة المحللة.
    2. إعداد التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف من المحللين في برنامج تلفزيوني.
    3. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 و 1 × 10-4 على لوحات TSB + الكونغو الحمراء واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 و 1 × 10-4 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي يبلغ 1 × 10-3 و 1 × 10-4 و 1 × 10-5 على التوالي.

5. مقايسة الغزو

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

  1. الثقافة الفرعية بين عشية وضحاها ثقافات الشيغيلا عبر التخفيف 1:50 إلى وسائط جديدة.
    1. دوامة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من كل مزرعة ليلية إلى 5 مل من TSB أو TSB + BS الطازج في أنبوب استزراع بحجم مناسب.
      ملاحظة: الحد من حجم الثقافة إلى <20٪ من دورق الثقافة أو حجم الأنبوب لضمان التهوية المناسبة.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلىOD 600 من 0.7 (مرحلة منتصف السجل من نمو الشيغيلا ) ؛ حوالي 2-2.5 ساعة.
      ملاحظة: خلال الاستزراع الفرعي ، قسمة 50 مل من DMEM + 50 ملغ / مل جنتاميسين وحجم كاف من PBS لجميع خطوات الغسيل ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. اترك الوسائط تصل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. نقل 2 × 108 CFUs الشيغيلة المستزرعة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 2 مل.
    ملاحظة: 2 × 108 CFUs يتوافق مع حوالي 1 مل من الخلايا البكتيرية عند OD600 من 0.7. استخدم قراءات OD600 لتقريب CFU / mL وفقا لمعايرة كل مقياس طيف ضوئي فردي.
  3. اغسل عينات الشيغيلا 1x باستخدام برنامج تلفزيوني.
    1. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ وأعد تعليق الحبيبات جيدا ، وقم بسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح الخليط متجانسا تماما (8-10x).
    2. كرر الخطوة 5.3.1. 1x وقت إضافي.
    3. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، ونضح المادة الطافية ، وإعادة تعليق الكريات في 2 مل من DMEM الدافئ.
      ملاحظة: سيكون التركيز النهائي للبكتيريا المعلقة 1 × 108 CFU / مل.
  4. دوامة ، ثم أضف 1 مل (1 × 108 CFUs) من الشيغيلة المعاد تعليقها بالإضافة إلى 1 مل من DMEM إلى كل بئر من الطبقات الظهارية القولونية HT-29 المحضرة في ألواح 6 آبار (من الخطوة 3.2.10.2).
    ملاحظة: يتم إجراء العدوى عادة عند تعدد العدوى (MOI ؛ نسبة الخلايا البكتيرية إلى الخلايا الظهارية) من 100. لاختبار MOIs المختلفة ، قم بتخفيف الشيغيلة المعاد تعليقها في DMEM إلى التركيز المطلوب ، ثم أضف 1 مل من البكتيريا المخففة إلى طبقة HT-29 أحادية. على سبيل المثال ، لاختبار MOI من 10 ، قم بتخفيف البكتيريا 1:10 بإضافة 150 ميكرولتر من 1 × 108 CFU / mL بكتيريا إلى 1.35 مل من DMEM ، ثم أضف 1 مل (1 × 107 CFUs) إلى خلايا HT-29.
  5. لتعزيز التلامس البكتيري مع خلايا HT-29 ، قم بطرد مركزي لألواح 6 آبار عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية إذا كان من الممكن ضبط إعداد درجة الحرارة.
    ملاحظة: يعزز الطرد المركزي الاتصال البكتيري بخلايا HT-29 ، مما يتجاوز الحاجة إلى عوامل الالتصاق ويسمح للبكتيريا بغزو الخلايا بسرعة.
  6. احتضان 6 ألواح آبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 45 دقيقة.
  7. أثناء الحضانة ، حدد عيار العدوى البكتيرية.
    1. تحضير التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف لخلايا الشيغيلا المعلقة (من الخطوة 5.3.3) إلى برنامج تلفزيوني.
    2. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 على لوحات TSB + الكونغو الحمراء واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي قدره 1 × 10-6 و 1 × 10-7 ، على التوالي.
  8. اغسل جيدا خلايا HT-29 المصابة 3x مع 1 مل من PBS.
    1. نضح الوسائط من كل بئر.
      ملاحظة: عند شفط الوسائط من ألواح ذات 6 آبار ، قم بتوجيه طرف الشافطة على طول الجانب السفلي من الآبار ، في محاولة لتجنب ملامسة خلايا HT-29.
    2. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر واغسله بلطف.
      ملاحظة: لغسل 6 طبقات أحادية اللون برفق باستخدام PBS ، حرك اللوحة لأعلى ولأسفل ومن جانب إلى آخر على سطح الطاولة. يمكن أن يؤدي غسل الألواح بحركة دائرية و / أو إزالة اللوحة من سطح الطاولة إلى الإزالة الميكانيكية للخلايا من البلاستيك.
    3. كرر الخطوتين 5.8.1 و 5.8.2 مرتين إضافيتين.
  9. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط ، ثم أضف 2 مل من DMEM الدافئ المكمل ب 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  10. اغسل جيدا خلايا HT-29 المصابة 3x مع 1 مل من PBS.
    1. كرر خطوة الغسيل 5.8.
  11. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط ، ثم أضف 2 مل من DMEM الدافئ المكمل ب 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر واحتضانه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  12. اغسل جيدا خلايا HT-29 المصابة 3x مع 1 مل من PBS.
    1. كرر خطوة الغسيل 5.8.
  13. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط وتحلل خلايا HT-29 بإضافة 1 مل من PBS + 1٪ Triton X-100 إلى كل بئر.
  14. احتضان 6 أطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  15. استخدم مكشطة خلية أو طرف ماصة منحني لكشط الخلايا المحللة من قاع البئر ونقل 1 مل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل.
  16. تحديد عدد البكتيريا داخل الخلايا.
    1. دوامة كل أنبوب (من الخطوة 5.15) لمدة 30 ثانية على الأقل لإزاحة الشيغيلة من الخلايا حقيقية النواة المحللة.
    2. إعداد التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف من المحللين في برنامج تلفزيوني.
    3. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 على لوحات TSB + الكونغو الحمراء واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي قدره 1 × 10-3 و 1 × 10-4 ، على التوالي.

6. مقايسة النسخ المتماثل داخل الخلايا

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

  1. الثقافة الفرعية بين عشية وضحاها ثقافات الشيغيلا عبر التخفيف 1:50 إلى وسائط جديدة.
    1. دوامة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من كل مزرعة ليلية إلى 5 مل من TSB أو TSB + BS الطازج في أنبوب استزراع بحجم مناسب.
      ملاحظة: الحد من حجم الثقافة إلى <20٪ من دورق الثقافة أو حجم الأنبوب لضمان التهوية المناسبة.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلىOD 600 من 0.7 (مرحلة منتصف السجل من نمو الشيغيلا ) ؛ حوالي 2-2.5 ساعة.
      ملاحظة: خلال الاستزراع الفرعي ، قسمة 50 مل من DMEM + 50 ملغ / مل جنتاميسين وحجم كاف من PBS لجميع خطوات الغسيل ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. اترك الوسائط تصل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. نقل 2 × 108 CFUs الشيغيلة المستزرعة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 2 مل.
    ملاحظة: 2 × 108 CFUs يتوافق مع حوالي 1 مل من الخلايا البكتيرية عند OD600 من 0.7. استخدم قراءات OD600 لتقريب CFU / mL وفقا لمعايرة كل مقياس طيف ضوئي فردي.
  3. اغسل عينات الشيغيلا 1x باستخدام برنامج تلفزيوني.
    1. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ وأعد تعليق الحبيبات جيدا ، وقم بسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح الخليط متجانسا تماما (8-10x).
    2. كرر الخطوة 6.3.1. 1x وقت إضافي.
    3. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، ونضح المادة الطافية ، وإعادة تعليق الكريات في 2 مل من DMEM الدافئ.
      ملاحظة: سيكون التركيز النهائي للبكتيريا المعلقة 1 × 108 CFU / مل.
  4. دوامة ، ثم أضف 1 مل (1 × 108 CFUs) من الشيغيلة المعاد تعليقها بالإضافة إلى 1 مل من DMEM إلى كل بئر من الطبقات الظهارية القولونية HT-29 المحضرة في ألواح 6 آبار (من الخطوة 3.2.10.2).
    ملاحظة: يتم إجراء العدوى عادة عند تعدد العدوى (MOI ؛ نسبة الخلايا البكتيرية إلى الخلايا الظهارية) من 100. لاختبار MOIs المختلفة ، قم بتخفيف الشيغيلة المعاد تعليقها في DMEM إلى التركيز المطلوب ، ثم أضف 1 مل من البكتيريا المخففة إلى طبقة HT-29 أحادية. على سبيل المثال ، لاختبار MOI من 10 ، قم بتخفيف البكتيريا 1:10 بإضافة 150 ميكرولتر من 1 × 108 CFU / mL بكتيريا إلى 1.35 مل من DMEM ، ثم ضع 1 مل (1 × 107 CFUs) على خلايا HT-29.
  5. لتعزيز التلامس البكتيري مع خلايا HT-29 ، قم بطرد مركزي لألواح 6 آبار عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية إذا كان من الممكن ضبط إعداد درجة الحرارة.
    ملاحظة: يعزز الطرد المركزي الاتصال البكتيري بخلايا HT-29 ، مما يتجاوز الحاجة إلى عوامل الالتصاق ويسمح للبكتيريا بغزو الخلايا بسرعة.
  6. احتضان 6 ألواح آبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 45 دقيقة.
  7. أثناء الحضانة ، حدد عيار العدوى البكتيرية.
    1. تحضير التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف لخلايا الشيغيلا المعاد تعليقها (من الخطوة 6.3.3) إلى برنامج تلفزيوني.
    2. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 على لوحات TSB + الكونغو الحمراء واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-5 و 1 × 10-6 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي قدره 1 × 10-6 و 1 × 10-7 ، على التوالي.
  8. اغسل جيدا خلايا HT-29 المصابة 3x مع 1 مل من PBS.
    1. نضح الوسائط من كل بئر.
      ملاحظة: عند شفط الوسائط من ألواح ذات 6 آبار ، قم بتوجيه طرف الشافطة على طول الجانب السفلي من الآبار ، في محاولة لتجنب ملامسة خلايا HT-29.
    2. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر واغسله بلطف.
      ملاحظة: لغسل 6 طبقات أحادية اللون برفق باستخدام PBS ، حرك اللوحة لأعلى ولأسفل ومن جانب إلى آخر على سطح الطاولة. يمكن أن يؤدي غسل الألواح بحركة دائرية و / أو إزالة اللوحة من سطح الطاولة إلى الإزالة الميكانيكية للخلايا من البلاستيك.
    3. كرر الخطوتين 6.8.1 و 6.8.2 مرتين إضافيتين.
  9. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط ، ثم أضف 2 مل من DMEM الدافئ المكمل ب 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  10. اغسل جيدا خلايا HT-29 المصابة 3x مع 1 مل من PBS.
    1. كرر خطوة الغسيل 6.8.
  11. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط ، ثم أضف 2 مل من DMEM الدافئ مع 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر من الألواح المكونة من 6 آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لطول الوقت المطلوب للسماح بالنسخ المتماثل داخل الخلايا (حتى 24 ساعة).
  12. اغسل الخلايا جيدا 2x مع 1 مل من PBS.
    1. كرر خطوة الغسيل 6.8.
  13. قم بإزالة PBS عن طريق الشفط وتحلل خلايا HT-29 بإضافة 1 مل من PBS + 1٪ Triton X-100 إلى كل بئر.
  14. احتضان 6 أطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  15. استخدم مكشطة الخلايا أو طرف الماصة المثني لكشط الخلايا المحللة من قاع البئر ونقل 1 مل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.7 مل.
  16. تحديد عدد البكتيريا داخل الخلايا.
    1. دوامة كل أنبوب (من الخطوة 6.15) لمدة 30 ثانية على الأقل لإزاحة الشيغيلة من الخلايا حقيقية النواة المحللة.
    2. إعداد التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف من المحللين في برنامج تلفزيوني.
    3. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 و 1 × 10-4 على ألواح TSB + Congo Red واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: طلاء 100 ميكرولتر من التخفيفات 1 × 10-2 و 1 × 10-3 و 1 × 10-4 يتوافق مع عامل تخفيف نهائي يبلغ 1 × 10-3 و 1 × 10-4 و 1 × 10-5 على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء فحوصات الالتصاق والغزو والتكرار داخل الخلايا بمقارنة النوع البري S. flexneri 2457T (WT) إلى S. flexneri ΔVF (ΔVF) ، وهو متحولة يفترض أنها تنظم ضراوة الشيغيلا بشكل سلبي. وبما أن الشيغيلا تستخدم الأملاح الصفراوية كإشارة لتنظيم الفوعة17،18،47، فقد أجريت التجارب بعد الاستزراع الفرعي البكتيري في أوساط مكتب تقييس الاتصالات وكذلك الأملاح الصفراوية بنسبة 0,4٪ (وزن/حجم)18. يعمل التعرض لأملاح الصفراء أثناء خطوة الاستزراع الفرعي كمعالجة مسبقة لتكرار العبور المعوي الدقيق قبل عدوى القولون17،18،47. يحلل الشكل 1 تأثير طفرة ΔVF على قدرة S. flexneri على الالتصاق بالخلايا الظهارية القولونية HT-29. يتم رسم النسبة المئوية للالتزام على المحور ص وتمثل نسبة البكتيريا المستعادة بعد تحلل HT-29 الموحد إلى عدد البكتيريا المدخلة. وكما هو متوقع، شهدت كل من سلالات S. flexneri WT و ΔVF زيادة كبيرة في الالتزام عند الاستزراع الفرعي مع مكملات الأملاح الصفراوية مقارنة ب TSB بدون مكملات الأملاح الصفراوية18. ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق في الالتزام بخلايا HT-29 بين سلالات WT و ΔVF الطافرة داخل كل حالة من حالات الثقافة الفرعية. تشير هذه البيانات إلى أن طفرة ΔVF ليس لها أي تأثير على قدرة S. flexneri على الالتصاق بالخلايا الظهارية HT-29 مع أو بدون الأملاح الصفراوية قبل المعالجة.

في الشكل 2 ، تم تحليل تأثير طفرة ΔVF على قدرة S. flexneri على الغزو (الشكل 2A) والتكاثر (الشكل 2B) داخل الخلايا الظهارية القولونية HT-29 مع أو بدون أملاح الصفراء قبل المعالجة. يتم رسم النسبة المئوية للاسترداد على المحور ص وتمثل نسبة الخلايا البكتيرية المستعادة بعد تحلل الخلايا HT-29 الموحد إلى عدد البكتيريا المدخلة. في الشكل 2 أ ، كانت هناك زيادة كبيرة متوقعة في قدرة WT S. flexneri 2457T على غزو خلايا HT-29 بعد التعرض المسبق للأملاح الصفراوية48 ، بينما أظهر متحولة S. flexneri ΔVF زيادة أقل في الغزو بعد التعرض المسبق للأملاح الصفراوية مقارنة بسلالة WT. وقد زاد طافر ΔVF من معدلات غزو خلايا HT-29 مقارنة ب WT المستزرع في TSB ، ولكن كان لديه معدلات غزو مماثلة ل WT عند الاستزراع الفرعي في TSB المكمل بالأملاح الصفراوية (الشكل 2A). تشير هذه النتائج إلى أن طفرة ΔVF تعزز قدرة S. flexneri على غزو خلايا HT-29 ، مما يقلل من تأثير الأملاح الصفراوية قبل التعرض على الرغم من أن قدرة غزو متحولة ΔVF زادت أكثر بعد الثقافة الفرعية للأملاح الصفراوية.

بشكل عام ، تم استرداد بكتيريا أكثر بمقدار 10 أضعاف بعد الحضانة الليلية (الشكل 2 ب) مقارنة بالحضانة لمدة 90 دقيقة (الشكل 2 أ) ، مما يوضح الاختلافات في مراقبة النمو داخل الخلايا مقابل الغزو ، على التوالي. عندما تم تحضين خلايا HT-29 المصابة لمدة 18 ساعة للسماح بتكرار البكتيريا داخل الخلايا (الشكل 2B) ، انخفض تأثير الأملاح الصفراوية قبل المعالجة لكل من سلالات WT و ΔVF . ومع ذلك ، كان التأثير المنخفض للأملاح الصفراوية قبل المعالجة أثناء النسخ المتماثل داخل الخلايا أكثر دراماتيكية بالنسبة لمتحولة ΔVF . نظرا لأن الزيادة في التكاثر داخل الخلايا لكلا السلالتين عند التعرض المسبق للأملاح الصفراوية كانت أصغر من الزيادة في معدلات الغزو في نفس الظروف ، فإننا نفترض أن الأملاح الصفراوية لها تأثير أكبر على الخطوات المبكرة في التسبب في S. flexneri . أظهر متحور ΔVF زيادة في النسبة المئوية للاسترداد من التكاثر الليلي داخل خلايا HT-29 مقارنة ب WT (الشكل 2B) بعد ظروف الاستزراع الفرعي. ومع ذلك ، كانت النسبة المئوية لاسترداد طفرة ΔVF متشابهة بغض النظر عن الأملاح الصفراوية قبل التعرض. تشير اتجاهات البيانات هذه إلى أن متحولة ΔVF تتكاثر بشكل أكثر كفاءة داخل خلايا HT-29 مقارنة ب WT ، وأن التعرض المسبق للأملاح الصفراوية لا يؤثر على قدرة طفرة ΔVF على التكاثر داخل الخلايا ، كما لوحظ ل WT (الشكل 2B). نظرا لأن الفرق بين سلالات الطفرة و WT في حالة ما قبل التعرض للأملاح الصفراوية لم يلاحظ خلال اختبار الغزو لمدة 90 دقيقة ، فإننا نفترض أن المنتج المشفر بواسطة جين VF المحذوف قد ينظم أيضا تكرار S. flexneri داخل خلايا HT-29. ويوضح كلا التحليلين مجتمعين أن متحور ΔVF أكثر ضراوة بالنسبة إلى WT، مما يشير إلى أن منتج جين VF هو منظم سلبي لضراوة S. flexneri .

Figure 1
الشكل 1: التصاق أملاح الصفراء قبل التعرض الناجم عن التصاق S. flexneri بخلايا HT-29. تم استزراع الخلايا الطافرة S. flexneri 2457T WT و ΔVF إما في TSB أو TSB مكملة بنسبة 0.4٪ (وزن / حجم) من الأملاح الصفراوية (TSB + BS) الوسط. ثم تم تطبيق البكتيريا على خلايا HT-29 عند تعدد العدوى (MOI) من 100 وحضنت لمدة 3 ساعات لفحص الالتزام. بعد الحضانة ، تم غسل خلايا HT-29 المصابة وتحليلها ، وتم طلاء التخفيفات التسلسلية للبكتيريا المستعادة لتعداد وحدات تكوين المستعمرات لكل مل (CFU / mL). يتم رسم عدد البكتيريا الملتصقة بالنسبة إلى عيار البكتيريا المدخلة لتحديد نسبة الالتزام. تمثل البيانات نسخة بيولوجية واحدة مع ثلاث مكررات تقنية (نقاط فردية). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (* p < 0.05 ؛ ***p < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: زاد التعرض لأملاح الصفراء قبل التعرض لغزو WT S. flexneri والتكاثر داخل الخلايا. تم استزراع الخلايا الطافرة S. flexneri 2457T WT و ΔVF إما في TSB أو TSB مكملة بأملاح صفراوية (TSB + BS) في الوسط. ثم تم تطبيق البكتيريا على خلايا HT-29 عند MOI من 100 ، والطرد المركزي على الخلايا ، وحضنت عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 لمدة 45 دقيقة. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتم تحليل البكتيريا خارج الخلية عن طريق إضافة الجنتاميسين إلى DMEM لاستعادة البكتيريا داخل الخلايا حصريا. بعد 90 دقيقة (A ، الغزو البكتيري) أو 18 ساعة (B ، التكاثر داخل الخلايا) ، تم غسل خلايا HT-29 المصابة وتحليلها ، وتم طلاء التخفيفات التسلسلية للبكتيريا المستعادة لتعداد وحدات تكوين المستعمرة لكل مل (CFU / mL). يتم رسم عدد البكتيريا داخل الخلايا بالنسبة إلى التتر البكتيري المدخلات لتحديد النسبة المئوية للاسترداد. تمثل البيانات نسخة بيولوجية واحدة ، لكل منها ثلاث نسخ تقنية (نقاط فردية). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (* p < 0.05). يرجى ملاحظة الاختلافات في مقاييس المحور ص بين اللوحتين (أ) و (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول مجموعة من ثلاثة مقايسات موحدة لدراسة التصاق الشيغيلة وغزوها وتكرارها داخل الخلايا للخلايا الظهارية المعوية. على الرغم من أن هذه الطرق هي مجرد نسخ معدلة من مقايسات الجنتاميسين الكلاسيكية المستخدمة لدراسة الغزو والتكاثر داخل الخلايا لمختلف مسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا المضيفة49،50،51 ، يجب تطبيق اعتبارات خاصة عند دراسة الشيغيلة.

الشيغيلة هي لاهوائية اختيارية ، تنمو على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية في وسط غني مع تهوية43. عند إجراء هذه المقايسات لاستجواب تأثيرات الإشارات البيئية المختلفة أو المستقلبات على عدوى الشيغيلا ، يوصى بزراعة الشيغيلة في الوسائط الغنية بين عشية وضحاها ، ثم الاستزراع الفرعي في وسائط محددة أو مكملة إلى مرحلة منتصف السجل قبل الإصابة. يحدث التعبير الجيني للضراوة القصوى خلال المرحلة اللوغاريتمية للنمو52,53. وبالتالي ، فإن زراعة مزارع الشيغيلا بين عشية وضحاها والسماح بنمو البكتيريا إلى المرحلة الأسية (OD600 ~ 0.7) هي خطوات ضرورية لتقييم ضراوة الشيغيلا بشكل صحيح. علاوة على ذلك ، يعتمد التعبير الجيني الفوعة على درجة الحرارة. لضمان خصوصية التعبير فقط أثناء عدوى المضيف ، يتم تحفيز جينات الفوعة في درجات حرارة فسيولوجية للمضيف (37 درجة مئوية) ويتم قمعها بشكل صارم في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال ، 30 درجة مئوية) 54. لضمان التعبير عن جينات الفوعة ، يجب إجراء الزراعة الفرعية البكتيرية والالتهابات عند 37 درجة مئوية ، مع العناية المناسبة لضمان عدم انخفاض درجة الحرارة عن 37 درجة مئوية. يعد بلازميد الفوعة الكبير الذي يبلغ حجمه 220 كيلوقاعدة ، والذي يشفر الآلية الجزيئية اللازمة للغزو وعدوى الخلايا الظهارية ، محددا أساسيا للضراوة لجميع Shigella spp5. يؤدي المرور المتكرر والنمو المطول عند 37 درجة مئوية إلى تعزيز عدم استقرار البلازميد الفوعة ، مما يؤدي إلى فقدان البلازميد وجعل خلايا الشيغيلا طيرة55. لضمان صيانة بلازميد الفوعة والتعبير عن جينات الفوعة الحاسمة ، يوصى بإعادة البكتيريا مباشرة من مخزون المجمد كل أسبوعين على لوحات مؤشر TSB + Congo الحمراء الطازجة. يمكن استخدام أجار الكونغو الأحمر للتمييز بين المستعمرات الخبيثة من النوع البري (الأحمر ، CR +) والمستعمرات الطيرية (البيضاء ، CR-) التي فقدت بلازميد الفوعة45. إذا لوحظ عدم استقرار بلازميد الفوعة بشكل متكرر ، يمكن تحضين مزارع الشيغيلا الليلية عند 30 درجة مئوية لمنع فقدان البلازميد الفوعة ، يليه الاستزراع الفرعي عند 37 درجة مئوية لتعزيز التعبير الجيني للفوعة43. أخيرا ، إذا تم إجراء تحليلات مع الطفرات و / أو السلالات المكملة ، حيث توجد علامات المضادات الحيوية في هذه السلالات البكتيرية ، فمن المستحسن استخدام الانتقاء المناسب للمضادات الحيوية أثناء البكتريا بين عشية وضحاها وخطوات الزراعة الفرعية.

استخدام أحاديات الظهارة HT-29 له العديد من المزايا لدراسة الآليات الجزيئية لتسبب Shigella في المختبر. نظرا لأن الشيغيلا هي مسببات الأمراض المتكيفة مع الإنسان ، فإن النماذج الحيوانية الصغيرة لا تعكس بدقة التسبب المميز لداء الشيغيلات الذي لوحظ في البشر36. وبالتالي ، فإن استخدام بروتوكولات موحدة لإصابة خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان يمكن من الاستجواب الكمي للخطوات الفردية للإمراض البكتيري لتوصيف التفاعل الجزيئي بين هذا العامل الممرض ومضيفه الأصلي. تاريخيا ، كانت خلايا هيلا تستخدم في الغالب لدراسة تفاعلات المضيف الممرض في المختبر25،56،57. ومع ذلك ، فإن خلايا HeLa هي خط خلايا سرطان عنق الرحم الخالد ، وهي خلايا مضيفة غير أصلية لمسببات الأمراض البكتيرية المعوية. وهكذا ، تحولت الدراسات في المختبر للتسبب المعوي إلى استخدام خطوط خلايا الورم الغدي القولوني (على سبيل المثال ، HT-29 و Caco-2 و T84) ، والتي تلخص بأمانة مورفولوجيا ظهارية معوية ، ويمكن زراعتها على التوابع كطبقات أحادية ظهارية مع أسطح قمية وقاعدية متباينة58،59،60. على الرغم من أن كل خط خلية له نقاط قوته وضعفه الفردية ، إلا أن خلايا HT-29 تستخدم في المقايسات الموصوفة هنا بسبب أوجه التشابه الظاهرية مع الخلايا المعوية المعوية والتعبير القوي لمستقبلات سطح الخلية والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات58،59،61. ومع ذلك ، فإن كل من هذه النماذج التي تمت مناقشتها عبارة عن خطوط خلايا مشتقة من السرطان مع أنماط ظاهرية أيضية ونمو شاذة لا تمثل بدقة الحالة الفسيولوجية الطبيعية لظهارة القولون في الجسم الحي58. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات زراعة الأنسجة البشرية من زراعة الخلايا الجذعية المعوية البشرية ، التي تم الحصول عليها من خزعات الأنسجة ، إلى عضويات أو طبقة أحادية الخلية أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد تلخص أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في الجهاز الهضمي البشري (GI)62،63،64. يمكن تمييز العضويات المعوية لتشمل الخلايا المعوية والخلايا الكأسية المنتجة للمخاط والخلايا M وأنواع الخلايا الأخرى الخاصة بالأنسجة. أثبتت الدراسات الحديثة صحة استخدام هذه النماذج العضوية لدراسة مسببات الأمراض المعوية ، بما في ذلك العديد من Shigella spp. ، والسالمونيلا المعوية ، و Escherichia coli pathovars62،63،64. على الرغم من أن الكائنات العضوية هي نماذج أكثر دقة لظهارة الجهاز الهضمي البشري ويمكن حتى استزراعها في ظروف مغذية متنوعة لتمثيل سكان العالم65 ، إلا أن تعقيدها النسبي يتطلب تدريبا كبيرا وخبرة فنية ، مما يؤدي إلى ارتفاع التكاليف وأوقات زراعة أطول مقارنة بخطوط الخلايا السرطانية التقليدية58.

يصف هذا البروتوكول طرق الإنتاجية المتوسطة ، حيث يتم استخدام لوحين من 6 آبار لما مجموعه 12 طبقة أحادية متاحة للاختبار. ومع ذلك ، يمكن بسهولة توسيع نطاق التجارب لزيادة عدد الطبقات الأحادية المصنفة من أجل استيعاب النسخ المتماثلة التقنية الإضافية ، أو اختبار طفرات الشيغيلا الإضافية والإشارات البيئية. يمكن أيضا استخدام ألواح زراعة الأنسجة التي تحتوي على المزيد من الآبار (على سبيل المثال ، ألواح 12 بئرا أو 24 بئرا) مع التعديلات المناسبة لحساب الآبار ذات الأقطار الأصغر. في ظل ظروف نمو HT-29 الموضحة في الخطوة 3.2 ، فإن عيارات HT-29 كافية لبذر حوالي ست لوحات من 6 آبار بعد الزراعة من قارورة T75 واحدة ، مع وجود خلايا متبقية كافية للحفاظ على ثقافة خلية HT-29. علاوة على ذلك ، فإن بذر أحادي الطبقات HT-29 وإعداد خطوات تلقيح البكتيريا متطابقة بين الالتصاق البكتيري والغزو ومقايسات النسخ المتماثل داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكن بسهولة إجراء فحوصات اختبار نفس سلالات الشيغيلا أو ظروف الاستزراع الفرعي بالتوازي لفحص دور كل حالة تجريبية في وقت واحد في خطوات مختلفة من عدوى الشيغيلا .

يتم تحديد عيار الاسترداد للبكتيريا الملتصقة (الخطوة 4) ، والغزوة (الخطوة 5) ، والبكتيريا داخل الخلايا (الخطوة 6) عن طريق طلاء التخفيفات التسلسلية لخلايا HT-29 المصابة بعد التحلل ، مما يتيح التقييم الكمي لكفاءة كل مرحلة من مراحل عدوى الشيغيلا. تعزز خطوات الطرد المركزي في مقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، بناء على المقايسات الكلاسيكية49،50،51 ، الاتصال البكتيري بالخلايا المضيفة للغزو الفوري وتعزيز معدلات الغزو. وبالتالي ، فإن الطرد المركزي "يتخطى" خطوة الالتزام ، والتي اكتشف لاحقا أنها جانب مهم من عدوى الشيغيلا 17،18،19،66. من الضروري ملاحظة أنه لا يمكن تنفيذ خطوة الطرد المركزي باستخدام الخلايا الظهارية المستقطبة المزروعة على أجهزة النقل. ومع ذلك ، بالنسبة لفحص الالتزام ، لا يتم فرض الالتزام عن طريق الطرد المركزي ، ولا يتم إضافة الجنتاميسين إلى خلايا HT-29 المصابة قبل التحلل ، مما يسمح بتعداد الخلايا البكتيرية الملتصقة. يتم تقليل حجم وسائط زراعة الأنسجة إلى 1 مل (مقابل 2 مل لمقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا) لتمكين اتصال أكثر كفاءة للبكتيريا مع خلايا HT-29. علاوة على ذلك ، اعتمادا على معدل الالتصاق ، يمكن أن يحدث بعض الغزو والتكاثر داخل الخلايا أثناء الحضانة لمدة 3 ساعات ، ولكن الكمية عادة ما تكون ضئيلة (على سبيل المثال ، 0.05٪ فقط من البكتيريا المستعادة بعد تحلل الخلية المضيفة). ومع ذلك ، لحساب البكتيريا الملتصقة مقابل البكتيريا داخل الخلايا بشكل صحيح خلال الحضانة لمدة 3 ساعات ، يوصى بإجراء مقايسات متوازية ، حيث ، بالإضافة إلى البروتوكول المذكور ، يتم تحضين صفيحة ثانية ب 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين في 2 مل من DMEM لكل بئر لمدة 45 دقيقة إجمالا (15 دقيقة حضانة ، غسل ، DMEM طازج + جنتاميسين لمدة 30 دقيقة) لتحلل البكتيريا خارج الخلية تماما. بعد تحلل الخلايا HT-29 كما هو مذكور في البروتوكول ، يمكن تعداد البكتيريا داخل الخلايا كما هو مذكور أعلاه ، وسوف تمثل عدد البكتيريا التي غزت. يمكن بعد ذلك طرح هذه القيمة من البكتيريا التي تم تعدادها من اللوحة دون معالجة الجنتاميسين لتحديد البكتيريا الملتصقة والغزوية بشكل مناسب. يمكن أيضا إجراء تحليلات متوازية لإعطاء مزيد من التبصر في التكاثر داخل الخلايا للشيغيلة داخل خلايا HT-29 بعد الغزو ، على سبيل المثال ، باستخدام نقاط زمنية متعددة لأداء منحنيات النمو داخل الخلايا. أخيرا ، إلى جانب تعداد البكتيريا داخل الخلايا بعد حضانة الجنتاميسين لمدة 18 ساعة ، يمكن جمع المواد الطافية المستزرعة وتحليلها بحثا عن إفراز السيتوكين لخلايا HT-29 المصابة. على سبيل المثال ، IL-8 هو كيموكين تفرزه الخلايا الظهارية التي تعمل إلى حد كبير لتجنيد PMNs إلى موقع العدوى. يمكن تحليل كمية IL-8 التي تفرز في وسائط الثقافة لخلايا HT-29 المصابة باستخدام اختبار IL-8 ELISA67.

أثبتت أملاح الصفراء أنها إشارة ضراوة مهمة للشيغيلة أثناء العبور عبر نظام الجهاز الهضمي البشري ، ويمكن استخدامها لتكملة وسائط نمو البكتيريا في هذه البروتوكولات لتكرار حالات GI النموذجية. بطبيعة الحال ، يتم إدخال الأملاح الصفراوية في الاثني عشر أو الجزء العلوي من الأمعاء الدقيقة للمساعدة في الهضم. وفي الدقاق الطرفي أو نهاية الأمعاء الدقيقة ، تتم إزالة 95٪ من الأملاح الصفراوية وإعادة تدويرها مرة أخرى في الدورة الدموية للإيداع النهائي في المرارة68. عادة ما يكون تركيز أملاح الصفراء بين 0.2٪ -2.0٪ (وزن / حجم) في الأمعاء الدقيقة وهي مبيدة للجراثيم بشكل طبيعي. ومع ذلك ، فإن الشيغيلة ، إلى جانب معظم البكتيريا المعوية ، تقاوم الأملاح الصفراوية وتستخدم الإشارات لتعزيز العدوى47. وثقت العديد من الدراسات كيف يؤثر التعرض للأملاح الصفراوية ، في بعض الأحيان بالتزامن مع إشارات معوية دقيقة أخرى مثل الجلوكوز ، على بقاء الشيغيلا وتنظيم الفوعة قبل الإصابة. لقد ثبت أن الشيغيلا تقاوم الأملاح الصفراوية ، وتغير التعبير الجيني ، وتشكل وتشتت الغشاء الحيوي في الظروف التي تعيد إنتاج العبور المعوي الصغير17،69. أظهرت الدراسات أن هذه التغييرات تؤدي إلى نمط ظاهري مفرط الضراوة ، حيث يتم تحفيز الالتصاق والغزو عند الإصابة القولونية اللاحقة بواسطة Shigella17،18،19،48،66. وبالتالي ، فإن الشروط الموضحة أعلاه توثق كيفية زراعة الشيغيلا الفرعية في الأملاح الصفراوية لتقليد العبور المعوي الدقيق قبل إجراء فحوصات الالتزام أو الغزو أو النسخ المتماثل داخل الخلايا. تحتوي تركيبة TSB المحددة على جلوكوز مضاف بالنسبة إلى مرق لوريا النموذجي (LB)17. وبالتالي ، إذا تم استخدام LB ، فمن المهم أيضا استكمال الوسائط بالجلوكوز (0.5٪ -2.0٪ [w / v]) للنظر بشكل مناسب في إشارات الجلوكوز في الأمعاء الدقيقة17. علاوة على ذلك ، كما ذكر أعلاه ، يتم غسل جميع مزارع الشيغيلا الفرعية لإزالة الأملاح الصفراوية وتقليد الانتقال إلى القولون لتحليل العدوى.

تقليديا ، وكما هو موضح في النتائج أعلاه (الشكل 1 والشكل 2) ، تعتبر فحوصات العدوى ذات قيمة لتحديد دور جين معين في عدوى الشيغيلا. ومع ذلك ، قد لا يتم تقدير النمط الظاهري لمختلف الطفرات حقا دون مكملات مناسبة لوسائط الثقافة البكتيرية. كما أظهرت الأبحاث السابقة ، فإن الأملاح الصفراوية تغير بشكل كبير التعبير الجيني S. flexneri ، بما في ذلك جينات التمثيل الغذائي المركزي ، وعوامل النسخ ، وناقلات السكر ، ومقاومة الأدوية ، وجينات الفوعة إما المشفرة على الكروموسوم أو بلازميد الفوعة17. توفر هذه الجينات نظرة ثاقبة حول كيفية استخدام الشيغيلة للأملاح الصفراوية كإشارة لتغيير التعبير الجيني والاستعداد للعدوى النهائية للقولون ، وبالتالي يجب إجراء التحليلات الطفرية اللاحقة في وسائط النمو البكتيرية المكملة المناسبة قبل فحص التأثيرات على الفوعة في مقايسات الالتصاق والغزو والتكرار داخل الخلايا. كما هو موضح أعلاه في الشكل 1 والشكل 2 ، لم تؤثر طفرة ΔVF على الالتزام ولكنها أثرت على الغزو والتكاثر داخل الخلايا. منذ أن عززت الطفرة الغزو والتكاثر داخل الخلايا ، تجري التجارب حاليا لتحديد كيفية تنظيم المنتج الجيني للعدوى. تعد التحليلات الطافرة مثالا على كيفية دراسة التفاهمات الجديدة في التسبب في الشيغيلة ، خاصة في الظروف التي تكرر بشكل أفضل الجهاز الهضمي البشري. يوصى بإجراء تحليلات تكميلية مناسبة للتحقق من صحة الأنماط الظاهرية لمختلف الطفرات.

في تركيبة ، تصف هذه الإجراءات التجارب الكمية التي ستوفر نظرة ثاقبة مهمة للآليات الجزيئية لالتزام الشيغيلة بالخلايا الظهارية القولونية HT-29 وغزوها وتكرارها من خلال محاكاة البيئة الطبيعية للجهاز الهضمي البشري أثناء العدوى بشكل أفضل. يمكن أن تتوسع الدراسات المستقبلية في الطفرات والظروف التجريبية للحصول على فهم أفضل لكيفية استعداد الشيغيلا للمضيفين البشريين وإصابتهم بشكل فعال. على الرغم من عقود من البحث، لا يزال هناك الكثير لاكتشافه حول عدوى الشيغيلا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يشمل دعم المؤلفين قسم طب الأطفال في مستشفى ماساتشوستس العام ، وجائزة اللجنة التنفيذية لتمويل الدعم المؤقت للأبحاث (ISF) 2022A009041 ، ومنحة المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية R21AI146405 ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى منحة مركز أبحاث السمنة الغذائية في جامعة هارفارد (NORCH) 2P30DK040561-26. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 204 ، الشيغيلة ، الالتزام ، الغزو ، التكاثر داخل الخلايا ، التسبب في المرض ، عوامل الفوعة ، الخلايا الظهارية ، الأملاح الصفراوية
تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع <em>الشيغيلة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter