Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ
Summary
Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is een nieuwe biosensor die het mogelijk maakt om continu cAMP-niveaus in levende cellen te meten. De biosensor is gemaakt van een circulair gepermuteerd fluorescerend eiwit dat is gekoppeld aan het scharniergebied van Epac2. Dit creëert een enkele fluorofoorbiosensor die een verhoogde of verlaagde fluorescentie vertoont bij binding van cAMP. De biosensor bestaat in rode en groene opwaartse versies, evenals groene neerwaartse versies, en verschillende rode en groene versies gericht op subcellulaire locaties. Om de effectiviteit van de biosensor te illustreren, werd de groene neerwaartse versie gebruikt, die in fluorescentie afneemt bij cAMP-binding. Er worden twee protocollen gedemonstreerd die gebruik maken van deze sensor: een die gebruik maakt van een 96-well plaatleesspectrofotometer die compatibel is met high-throughput screening en een andere die gebruik maakt van single-cell beeldvorming op een fluorescentiemicroscoop. Op de plaatlezer werden HEK-293-cellen gekweekt in platen met 96 putjes gestimuleerd met 10 μM forskoline of 10 nM isoproterenol, wat een snelle en grote afname van de fluorescentie veroorzaakte in de groene neerwaartse versie. De biosensor werd gebruikt om cAMP-niveaus te meten in individuele cellen van gladde spieren van de menselijke luchtwegen (HASM) die onder een fluorescerende microscoop werden gecontroleerd. De groene neerwaartse biosensor vertoonde vergelijkbare reacties op celpopulaties wanneer deze werd gestimuleerd met forskolin of isoproterenol. Deze eencellige test maakt visualisatie van de locatie van de biosensor mogelijk bij een vergroting van 20x en 40x. Deze cAMP-biosensor is dus gevoelig en flexibel, waardoor real-time meting van cAMP mogelijk is in zowel onsterfelijke als primaire cellen, en met afzonderlijke cellen of populaties van cellen. Deze eigenschappen maken cADD een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cAMP-signaleringsdynamiek in levende cellen.
Introduction
Adenosine 3′,5′-cyclisch monofosfaat, cAMP, speelt een centrale rol in cellulaire communicatie en de coördinatie van verschillende fysiologische processen. cAMP fungeert als een tweede boodschapper en geeft externe signalen van hormonen, neurotransmitters of andere extracellulaire moleculen door om een cascade van intracellulairegebeurtenissen op gang te brengen. Bovendien is cAMP nauw betrokken bij verschillende signaalroutes, waaronder die geassocieerd met G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR’s) en adenylylcyclasen. Het begrijpen van de rol van cAMP in cellulaire signalering is van fundamenteel belang voor het ontrafelen van de complexe mechanismen die ten grondslag liggen aan normale cellulaire functies en de ontwikkeling van mogelijke therapieën voor een breed scala aan medische aandoeningen.
In het verleden zijn er verschillende methoden gebruikt om cAMP direct of indirect te meten. Deze omvatten radiolabeling van cellulaire ATP-pools gevolgd door kolomzuivering, HPLC, radioimmunoassays en enzymgekoppelde immunoassays 1,2. Deze legacy-assays worden beperkt door het feit dat het eindpuntmetingen zijn, waarvoor een groot aantal monsters nodig is om tijdafhankelijke responsen te construeren. Meer recentelijk werden Fluorescentie Resonantie Energie Transfer (FRET) sensoren ontwikkeld om testen in levende cellen te maken, real-time, dynamische gegevens te produceren en het mogelijk te maken om sensoren op verschillende subcellulaire locaties te richten3. FRET maakt gebruik van twee fluoroforen, een fluorescerende donor en een fluorescerende acceptor die, wanneer hij in de buurt is, de acceptorfluorofoor zal worden opgewonden door de fluorescerende output van de donor. De twee meest gebruikte fluoroforen zijn cyaan fluorescerend eiwit (CFP) en geel fluorescerend eiwit (YFP), omdat deze compatibele excitatie- en emissie-eigenschappen hebben. Naast CFP en YFP wordt het gebruik van het groen fluorescerende eiwit (GFP) en het rood fluorescerende eiwit (RFP) vaak gebruikt voor FRET-biosensoren. cAMP FRET-biosensoren werken door een donor en acceptor aan weerszijden van het Epac2 cAMP-bindende eiwit te hebben. cAMP-binding verandert de bevestiging van Epac en vergroot de afstand tussen donor- en acceptorfluoroforen 3,4. Deze conformatieverandering wordt gedetecteerd door een verlies van FRET, dat wil zeggen de excitatie van de acceptorfluorofoor door energie die wordt overgedragen door de donorfluorofoordruppels3. Hoewel het een ogenschijnlijk eenvoudig proces is, zijn er tal van beperkingen en problemen met de FRET-biosensor voor cAMP-onderzoek5. Een daarvan is de selectie van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld GFP, die op natuurlijke wijze kunnen dimeriseren, waardoor de gevoeligheid wordt verminderd6. Op FRET gebaseerde cAMP-biosensoren zijn gericht op specifieke microdomeinen7, maar er kunnen beperkingen zijn vanwege de grote omvang van een constructie met twee fluoroforen6. Een ander belangrijk probleem is de lage signaal-ruisverhouding van FRET-signalen als gevolg van de overlap tussen excitatie en emissie van de fluorofoor, wat resulteert in een hoge bemonsteringsfrequentie en de analyse van de resultaten bemoeilijkt 4,5.
Meest recentelijk heeft de nieuwe biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, deze en andere beperkingen opgelost als het gaat om het bestuderen van de regulatie van cAMP-signalering8. Een belangrijke verbetering is de afhankelijkheid van een enkele fluorofoor. Dit zorgt voor een snel en efficiënt signaal met een groter dynamisch bereik en een hoge signaal-ruisverhouding. Als gevolg hiervan kan er meer nauwkeurigheid zijn omdat er een minder breed scala aan golflengten is om door te kammen8. Net als FRET-sondes is de biosensor gericht op subcellulaire locaties, waardoor onderzoek naar de compartimentatietheorie en exploratie in lipidevlotten en niet-vlotten en andere subcellulaire domeinen mogelijkis. Misschien wel het belangrijkste is de geschiktheid van een enkele fluorofoor biosensor voor high-throughput screening, die de gevoeligheid en reproduceerbaarheid heeft verbeterd ten opzichte van FRET-gebaseerde biosensoren. De biosensor is verpakt in een BacMam-vector voor eenvoudige transductie van een breed scala aan celtypen en nauwkeurige controle over eiwitexpressie.
Expressiecontrole via de BacMam-vector kan met name nuttig zijn bij assays met GPCR-orthologen van verschillende diersoorten om de interpretatie van gegevens uit dierstudies te vergemakkelijken. Bovendien is controle over de receptorexpressie van cruciaal belang voor het meten van de verschillende graden van werkzaamheid van geneesmiddelen (bijv. inverse agonisten en gedeeltelijke agonisten), en lage niveaus van receptorexpressie zijn nuttig om de lage niveaus na te bootsen die in dierlijk weefsel worden aangetroffen. BacMam is een baculovirusvector die is gemodificeerd om zoogdiercellen zoals primaire celculturen en HEK-293-lijnen10 te transduceren. Dominante selecteerbare markers zorgen ervoor dat BacMam meer stabiliteit biedt ten opzichte van traditionele plasmide-infecties11. Dergelijke selectieve promotors zorgen voor een efficiëntere afgifte en expressie van genen. Bovendien verhoogt het toevoegen van trichostatine A (een histondeacetylaseremmer) de reporter-eiwitspiegels11. Expressieniveaus kunnen worden gecontroleerd via de titer van het gebruikte BacMam-virus en moeten voor elk celtype worden geoptimaliseerd. In het geval van deze biosensor is een rood of groen fluorescerend eiwit gekoppeld aan de Epac bij de N- en C-termini. Wanneer cAMP bindt, verplaatst een conformationele verandering in de biosensor aminozuren naast het fluorescerende eiwit. Een dergelijke verschuiving verplaatst de absorptie van de anionische toestand naar de neutrale toestand bij 400 nm, waardoor de fluorescentie afneemt.
Er zijn 90-120 GPCR’s die tot expressie komen in een enkele cel die reageren op een breed scala aan neurohumorale signalen12. Daarom kan worden verondersteld dat ten minste enkele tientallen GPCR’s per cel cAMP kunnen stimuleren of remmen door respectievelijk Gs- of Gi-koppeling. Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het monitoren van deze tweede boodschapper in realtime, zoals FRET, zijn er efficiëntere methoden nodig. De methodologie voor het monitoren van de synthese en degradatie van cAMP-signalen met behulp van cADDis in real-time wordt hier gepresenteerd. De verandering in fluorescentie kan in real-time worden gecontroleerd met behulp van een fluorescentieplaatlezer voor tests met een hoge doorvoer of met behulp van een fluorescentiemicroscoop voor tests met één cel. Deze methoden zijn nuttig voor een breed scala aan biologische vragen met betrekking tot GPCR-signalering via cAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige en gevoelige meting van cAMP is cruciaal voor het begrijpen van de rol ervan in verschillende cellulaire processen en voor het bestuderen van de activiteit van cAMP-afhankelijke signaalroutes. Er zijn verschillende methoden die vaak worden gebruikt om cAMP-niveaus te meten, waaronder ELISA, radioimmunoassay, FRET-biosensoren en de GloSensor cAMP-test 14,15,16,17,18.<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
