本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。
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本文内容
摘要
摘要
基因治疗是一种强大的技术，可通过向患者体内递送新基因来治疗疾病，无论是引入功能性基因、失活毒性基因，还是提供一种其产物可调节疾病生物学过程的基因。治疗性载体的递送方式有多种，从用于全身递送的静脉输注，到直接注射至靶组织。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。靶向整个中枢神经系统的侵入性最小的方法是将药物注射至脑脊液（CSF）中，从而使治疗剂能够到达中枢神经系统的大部分区域。将载体递送至脑脊液中最安全的方法是腰椎鞘内注射，即通过穿刺针进入脊髓的腰池。该技术也称为腰椎穿刺，在新生期和成年啮齿类动物以及大型动物模型中已得到广泛应用。尽管该技术在不同物种和发育阶段之间具有相似性，但围绕鞘内腔的组织在大小、结构和弹性方面的细微差异，要求在操作方法上做出相应调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关病毒血清型9载体的方法。在此过程中，将25–35 µL的载体注入腰池，并使用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因评估每次注射所产生的转导分布情况。文中还讨论了该方法的优势与挑战。
引言
近年来，随着美国食品药品监督管理局（FDA）批准了针对脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、凝血因子IX缺乏性血友病、癌症等多种疾病的病毒介导基因疗法，基因治疗的前景终于得以实现1,2,3,4。目前还有 countless 其他疗法正处于研发阶段。基因治疗旨在将治疗性基因递送至患者的细胞中，该新基因的表达产物可弥补内源性缺陷基因所缺失的功能、抑制有毒基因的表达、杀死癌细胞，或提供其他有益的生物学功能。
对于影响中枢神经系统（CNS）的疾病，通常希望将基因治疗载体直接递送至靶组织。非全身性给药方法具有两个优势：一是可最大限度减少因外周转导引起的脱靶副作用，二是可显著减少在靶组织中实现足够转导水平所需的载体用量5。
向中枢神经系统（CNS）递送基因治疗载体有多种方法。实质内注射是指将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于向特定区域递送。然而，对于许多疾病而言，需要实现中枢神经系统的广泛转导。这可以通过将载体递送至脑脊液（CSF）5来实现，脑脊液是流经并环绕脑和脊髓的液体。将载体递送至脑脊液主要有三种方式。侵入性最强的方法是脑室内注射，需在颅骨上钻孔，并将针头穿过脑组织进入侧脑室，可在全脑实现转导。然而，该操作可能导致颅内出血，且通常在脊髓中的转导范围有限6。向颅底的大脑池（cisterna magna）注射侵入性较小，但存在损伤脑干的风险。尽管该方法常用于动物研究5，但在临床实践中已不再常规使用7。腰椎穿刺是侵入性最小的脑脊液接触方式，操作时将针头插入两个腰椎椎体之间的腰池。
腰椎穿刺用于载体递送在成年大鼠和小鼠以及新生小鼠中常规进行8,9。本研究的作者近期在幼年大鼠（28–30日龄）中实施了腰椎穿刺以递送9型腺相关病毒血清型（AAV9）载体。在成年大鼠中，使用新生儿腰椎穿刺针垂直插入L3与L4椎体之间9。正确置针的标志是出现尾部抽动以及脑脊液流入针头储液腔。然而，在幼年大鼠中，这两种可观察指标均无法实现。随后，作者尝试采用成年小鼠的操作方法，使用27 G胰岛素注射器以一定角度插入L5与L6之间10。在体型通常小于P28大鼠的成年小鼠中，该操作不会引起尾部抽动，但针头位置错误可通过注射液回流而被察觉。然而在幼年大鼠中，该方法始终导致注射液被递送至硬膜外腔，这可能源于成年小鼠与幼年大鼠在脊髓周围组织层弹性上的差异。随后评估了导管递送方法。具体而言，通过腰池硬膜上的切口插入导管，并将其上行至胸段脊髓中部；然而，该方法在递送过程中导致大量注射液从切口部位反流。尝试使用引导针经皮将导管置入蛛网膜下腔也未成功。由于椎板间隙较窄，导管很可能撞击头端椎板而无法继续前进。
此处描述了一种实现成功且可重复溶液递送的方法 通过 在幼年大鼠中进行腰椎穿刺。该方法可用于病毒载体，也可能适用于细胞、药物及其他治疗剂。
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方案
本研究经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究采用斯普拉格-道利大鼠（年龄28-30天，体重约90-135 g，雄性和雌性）。
1. 载体的制备
- 在实验开始时，将AAV9载体（参见材料表）置于冰上解冻。
- 将含有载体的微量离心管在台式离心机中短暂离心，以确保所有液体均位于管底。
- 轻轻弹击微量离心管，确保溶液充分混匀。
2. 恢复笼的制备
- 将一个干净的笼子放在电热毯上（参见材料表），使笼子仅有一半与电热毯接触。
- 将电热毯的温度设置为约37 °C。
3. 手术平台的准备
- 将等温垫（见材料表）在微波炉或水浴中加热至 39 °C，使其内容物变为液态。
- 将等温垫放置在手术平台上，并用干净的吸水实验台垫覆盖。
4. 动物准备
- 使用异氟烷在透明箱中对大鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。麻醉诱导开始时使用5%异氟烷，随后每分钟降低1%，直至达到2%。维持动物在2%浓度下额外3分钟。
- 将装有动物的箱子移至通风橱并打开箱盖。
注意：此举可限制外科医生接触麻醉气体。 - 使用电动剪毛器去除动物背部的毛发。
注意：也可选用脱毛膏或手动剃刀配合剃须膏进行脱毛。 - 将动物放置于手术台上，使其鼻部进入麻醉鼻罩。
注意：在手术区域去毛过程中，动物可能开始恢复意识。若发生此情况，应按照上述方法重新麻醉。 - 为每只眼睛涂抹润滑性眼膏，以防止手术期间角膜干燥。
- 使用聚维酮碘和异丙醇擦拭巾交替消毒手术区域，共进行三次。
- 皮下注射镇痛药。
注意：通常使用丁丙诺啡，剂量为0.01–0.05 mg/kg，每12小时给药一次。 alternatively，可单次给予缓释型丁丙诺啡1 mg/kg，以提供长达72小时的有效镇痛。有关疼痛管理的具体指南，请咨询所在机构的IACUC。 - 在L2至L6棘突上方皮下注射100 µL的1%利多卡因，以实现局部麻醉。
- 在动物髋部前方稍靠头侧位置放置一卷纸巾或直径为1.5 cm的管状物。这有助于脊柱屈曲，便于将针头插入两个椎板之间。
- 将带开窗的手术巾（见材料表）覆盖于动物体表，使开窗部位对准腰椎区域。
5. 暴露腰椎
- 通过捏压动物的每只爪子，观察是否无回缩反应，以确认麻醉深度。
- 使用#11手术刀片，从L2至L6沿中线在皮肤上做一个约3 cm长的切口。
- 将无菌弯头手术剪插入肌肉与皮肤之间，然后张开剪刀尖端，以分离皮肤与肌肉。
- 去除覆盖L2-L5棘突的筋膜。
6. 注射器的装载
- 将25–35 µL载体（以达到所需剂量）移液至无菌微量离心管的管盖中。
- 用胰岛素注射器吸取全部液体。
注意：此过程中务必避免吸入空气。
7. 进行注射
- 确定L5和L4棘突的位置。
注意：L6位于两侧髂嵴连线的正中央，其棘突可通过钝性器械探查而易于识别。随后可将器械沿背部轻柔向上滑动，以确定L5和L4棘突的边界。 - 将一只手放置妥当，使拇指轻轻置于动物的尾巴和一条后肢上。用另一手指固定注射器。
- 将注射器针头置于L5棘突左侧，对准其尾端。注射器应与身体正中线呈约30°角，并与实验台平面呈约30°向上倾斜。
注意：可借助手术显微镜以更清晰地识别解剖标志，并准确定位针尖位置。 - 向前推进针头约8 mm，越过L5椎板上方，继而穿过L4椎板下方进入腰池，直至触及骨质。正确穿刺时，可观察到或通过置于后肢/尾巴上的拇指感知到后肢和/或尾巴的短暂抽动。若未出现抽动，应退出针头并尝试从左侧重新穿刺。若仍无抽动，可根据需要在L4/L3或L3/L2间隙重复操作。
- 缓慢推动活塞，持续约5秒。
注意：注射过程中可能出现后肢或尾巴的抽动。 - 在完全推注完毕后，保持注射器位置不动约30秒，以使压力达到平衡，从而在拔出针头时尽量减少注入物的反流。
- 缓慢拔出针头。
8. 切口的闭合
- 对切口边缘进行对合。
- 从伤口的一端开始，使用4-0缝线（参见材料表）或外科缝钉闭合切口。
9. 恢复与监测
- 将动物放入预热的笼子中。
- 至少每15分钟检查一次动物，直至其完全恢复自主活动能力。
注意：此过程通常需要15至45分钟。 - 术后接下来的三天内，每天至少进行一次健康状况检查。术后前两天给予镇痛药物，或根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）的要求给予镇痛剂。
- 术后一周，拆除缝线或钉合夹。
10. 随访程序
注意：为了确定注射技术的准确性，按照上述方法注射台盼蓝染料，然后立即处死动物（遵循机构批准的方案），并进行椎板切除术以观察结果。
- 在动物仍处于麻醉状态时，通过注射致死剂量的戊巴比妥将其安乐死 通过 腹腔注射，剂量为150 mg/kg。
- 呼吸和心脏活动停止后，打开胸腔以确认死亡。 将手术切口从背部向上延伸至颈部。
- 在棘突两侧的肌肉上，沿脊柱方向平行切开长约4 cm的切口，尽量靠近棘突。
- 使用精细镊子或剪刀，去除棘突之间的肌肉组织。
- 使用咬骨钳从L6向上至下胸段脊柱去除棘突（参见 材料表避免扭转操作，以免损坏咬骨钳。
- 将咬骨钳的尖端插入L5椎板下方，通过分次操作去除覆盖脊髓的骨质 "咬伤" 从中取出。
注意：向后牵拉L6棘突可便于咬骨钳尖端的插入，但必须小心操作以避免损伤脊髓。 - 继续向头侧扩大椎板切除范围，至少四个椎板。检查椎板内表面是否有染料痕迹，如有则提示注射失败。
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结果
为了评估注射技术的准确性，使用染料台盼蓝作为治疗药物的替代物。该染料可快速与蛋白质结合，因此通常保留在其被注射入的结构内。这意味着染料可能无法准确预测治疗药物在注射后的实际分布情况；它仅用于显示注射是否准确。当成功注入腰池时，台盼蓝会结合硬脊膜，使脊髓周围区域呈现蓝色。然而，若穿刺针未能穿透硬脊膜，染料则会停留在硬膜外腔。此时，硬脊膜以及周围组织（骨表面、连接椎板的韧带和肌肉）均会被染成蓝色。这些染色模式肉眼即可清晰辨别。
如果仅对脊髓和脊柱进行横向切割，很难评估注射操作是否正确。相反，建议使用咬骨钳从L5椎板开始，向头侧方向进行椎板切除术。在此过程中必须注意不要损伤硬脑膜。使用解剖显微镜可使该过程更为简便。图1提供了成功注射与部分成功注射的对比示例。成功注射时，在拔出针头后，针道内几乎没有或完全没有染料回流现象。成功注射后，去除椎板以暴露脊髓，可见脊髓内部含有台盼蓝，但骨表面无染料分布（图1A）。此外，在成功注射后，脑干和小脑上也可观察到染料（
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讨论
中枢神经系统（CNS）会受到多种疾病的影响。对于那些具有隐性单基因性质的疾病，例如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体递送功能正常的基因拷贝是一种具有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障（BBB）会阻止大多数经静脉给予的基因治疗载体进入脑组织11。即使某些载体能够穿越血脑屏障，例如AAV9，也必须使用高剂量给药，以弥补因外周组织转导造成的载体损失12。年龄也是一个限制因素。随着年龄增长，人体对各种AAV血清型的环境暴露增加13，常常导致产生可中和治疗性载体的抗体14。因此，针对中枢神经系统疾病的基因治疗载体经静脉递送通常仅限于婴儿，而不用于成年后确诊的患者。
对于老年患者，将载体直接注射到脑脊液中可实现中枢神经系统的广泛转导，从而避开血脑屏障和已存在的抗AAV抗体15由于该方法具有靶向性，因此也可使用较低的载体剂量。在临床应用中主要有两种途径：（1）腰椎穿刺...
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披露
Donsante 博士是关于 AAV9 载体脑脊液给药的一项待批准专利的发明人。
致谢
作者谨此感谢德克萨斯大学西南医学中心的 Steven Gray、Matthew Rioux、Nanda Regmi 和 Lacey Stearman 就幼年大鼠在鞘内注射操作中所带来挑战的富有成效的讨论。本研究部分得到了 Jaguar Gene Therapy 公司资助（资助对象：JLFK）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200 µL 过滤吸头 | MidSci | PR-200RK-FL | 病毒移液 |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | 表达 GFP 的 AAV9 载体 |
| 带针可吸收缝线，涂覆 Vicryl 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 910，FS-2，3/8 圆弧反向切割针，4-0 编织线 | McKesson | J422H | 缝合线 |
| 实验台垫 | VWR | 56616-031 | 手术 |
| Braintree Scientific 恒温垫，8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | 维持体温 |
| 布托啡诺 | McKesson | 1013922 | 镇痛剂 |
| 缓释布托啡诺（1 mg/mL） | Zoopharma | 长效镇痛剂 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 19-365-409 | 清除血液 |
| 手术洞巾，小鼠用，透明塑料，12" x 12"，带粘性开窗 | Steris | 1212CPSTF | 手术洞巾 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | 镊子 |
| 电热毯 | CVS Health | CVS Health 系列 500 加长型加热垫 | |
| Eppendorf Research plus 单通道可调移液器，20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | 病毒移液 |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14059-11 | 弯头手术剪 |
| Friedman-Pearson 咬骨钳 | Fine Science Tools | 16121-14 | 椎板切除术 |
| Halsey 持针器 | Fine Science Tools | 12001-13 | 持针钳 |
| 胰岛素注射器，超细针头，12.7 mm x 30 G，3/10 mL/cc | BD | 328431 | 注射器 |
| 异氟烷 | McKesson | 803250 | 麻醉剂 |
| 异丙醇擦拭巾 | Fisher Scientific | 22-031-350 | 皮肤消毒 |
| 利多卡因，1% | McKesson | 239935 | 局部麻醉 |
| 微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | 注射器装液 |
| 聚维酮碘 | Fisher Scientific | 50-118-0481 | 皮肤消毒 |
| 手术刀柄 - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | 手术刀片夹持器 |
| Sure-Seal 吸入麻醉诱导室 | Braintree Scientific | EZ-17 | 麻醉箱 |
| 手术刀片 Miltex 碳钢，No. 11，无菌一次性独立包装 | McKesson | 4-111 | #11 手术刀片 |
| SYSTANE NIGHTTIME 眼膏 | Alcon | 眼膏 | |
| 台盼蓝 | VWR | 97063-702 | 注射 |
参考文献
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