腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

サマリー

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。

要約

遺伝子治療は、機能遺伝子の導入、毒性遺伝子の不活性化、または製品の疾患生物学を調節できる遺伝子の提供など、疾患の治療のために患者に新しい遺伝子を送達するための強力な技術です。治療用ベクターの送達方法は、全身送達のための静脈内注入から標的組織への直接注入まで、さまざまな形態をとることができます。神経変性疾患の場合、形質導入を脳や脊髄に偏らせることが望ましいことがよくあります。中枢神経系全体を標的とする最も侵襲性の低いアプローチには、脳脊髄液(CSF)への注射が含まれ、治療薬が中枢神経系の大部分に到達することを可能にします。CSFにベクターを送達する最も安全なアプローチは、針を脊髄の腰椎槽に導入する腰椎髄腔内注射です。この技術は、腰椎穿刺とも呼ばれ、新生児や成体のげっ歯類、および大型動物モデルで広く使用されています。この手法は種や発生段階によって似ていますが、髄腔内空間を取り巻く組織のサイズ、構造、弾力性の微妙な違いにより、アプローチには適応が必要です。この記事では、アデノ随伴血清型9ベクターを送達するために、幼若ラットに腰椎穿刺を行う方法について説明します。ここでは、25〜35μLのベクターを腰椎槽に注入し、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを使用して、各注入から生じる形質導入プロファイルを評価しました。このアプローチの利点と課題について説明します。

概要

近年、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、第IX因子血友病、がんなどの治療薬がFDAに承認されたことで、ウイルス媒介性遺伝子治療の有望性がついに実現されました1,2,3,4。現在、他にも数え切れないほどの治療法が開発されています。遺伝子治療は、治療用遺伝子を患者さんの細胞に届けることを目的としています。この新しい遺伝子の産物は、欠損した内因性遺伝子の欠落した活性を補ったり、毒性遺伝子を阻害したり、がん細胞を殺したり、その他の有益な機能を提供したりすることができます。

中枢神経系(CNS)に影響を与える疾患では、遺伝子治療ベクターを標的組織に直接送達することが望ましい場合が多いです。非全身的アプローチは、末梢形質導入によって引き起こされる可能性のあるオフターゲット副作用を最小限に抑えることと、^{標的組織5}で適切なレベルの形質導入を達成するために必要なベクターの量を大幅に減少させるという2つの利点を提供する。

遺伝子治療ベクターをCNSに送達するには、さまざまなアプローチがあります。実質内注射は、ベクターを脊髄または脳組織に直....

プロトコル

この研究は、エモリー大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(生後28-30日齢、体重約90-135g、雄と雌)を用いた。

1. ベクターの調製

1. 手順の開始時に、AAV9ベクター( 材料の表を参照)を氷上で解凍します。
2. ベクターを含む微量遠心チューブを卓上型遠心分離機で短時間遠心分離し、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。
3. 微量遠心チューブを静かにフリックして、溶液が十分に混合されていることを確認します。

2.リカバリーケージの準備

1. 清潔なケージを電気毛布( 材料の表を参照)に置き、ケージの半分だけが毛布に接触するようにします。
2. ブランケットの温度を~37°Cに設定します。

3.手術台の準備

1. 等温パッド( 材料の表を参照)を電子レンジまたはウォーターバスで39°Cに温め、内容物が液体になるようにします。
2. 等温パッ....

結果

注射技術の精度を決定するために、染料であるトリパンブルーを治療薬の代用として使用した。この色素はタンパク質に容易に結合するため、通常、注入された構造内に留まります。これは、色素が治療薬の注射後の分布を正確に予測できない可能性があることを意味します。これは、単に注入の精度を明らかにするために使用されます。腰椎槽にうまく導入されると、トリパンブルーは硬膜に結合し、脊髄の周囲を青く染めます。しかし、針が硬膜を貫通できないと、染料は硬膜外腔に行き着きます。硬膜と周囲の組織(骨の表面と椎弓板をつなぐ靭帯と筋肉)の両方が青色に染色されます。これらのパターンは肉眼で簡単に見ることができます。

正しく投与された注射と誤って投与された注射の違いは、脊髄と脊柱を横方向に切断するだけで評価することは困難です。代わりに、L5 椎弓板から始まり、吻側に移動する rongeurs のペアを使用して椎弓切除術を行うことをお勧めします。その過程で硬膜を傷つけないように注意する必要があります。解剖顕微鏡を使用すると、このプロセスが容易になります。 図 1 .......

ディスカッション

CNSにはさまざまな疾患が罹患しています。ウイルスベクターを介して関連遺伝子の機能的コピーを提供することは、脊髄性筋萎縮症など、本質的に劣性で単一遺伝子である患者にとって魅力的な治療戦略です。ただし、血液脳関門 (BBB) は、静脈内投与されるほとんどの遺伝子治療ベクターを除外します¹¹。AAV9のようなBBBを通過できるものは、末梢形質導入によるベクター損失を克服するために高用量で投与しなければならない¹²。年齢も障壁です。種々のAAV血清型への環境曝露は^、13 歳とともに増加し、しばしば治療用^{ベクター14}を中和できる抗体の産生につながる。したがって、CNS障害に対する遺伝子治療ベクターの静脈内送達は、一般に乳児に限定されており、後年診断された患者には使用されません。

高齢の患者の場合、CSFへの直接ベクター注入は、BBB抗体と既存の抗AAV抗体の両方をバイパスして、CNSで広範な形質導.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
200 µLフィルター付きピペットチップ	MidSci	PR-200RK-FL	ピペッティングウイルス
AAV9-GFP	ベクタービルダー	P200624-1005ynr	GFPを発現するAAV9ベクター
ニードルコーティング付き吸収性縫合糸 Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 サークルリバースカッティングニードル サイズ 4 - 0 編組	マッケソン	J422H	縫合
ベンチパッド	VWR	56616-031	手術
Braintree Scientific Isothermal Pads、8インチ x 8インチ	フィッシャーサイエンティフィック	50-195-4664	体温を維持
Buprenorphine	McKesson	1013922	鎮痛剤
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		徐放性鎮痛剤
綿	フィッシャーサイエンティフィック	19-365-409	血液除去
ドレープ、マウス、透明プラスチック、12インチ x 12インチ、接着剤付き 開窓	Steris	1212CPSTF	外科用ドレープ
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11251-20	鉗子
電気ブランケット	CVS Health		CVS Health Series 500 超長熱パッド
Eppendorf Research plus、1チャンネルピペット、可変、20–200 µL	Eppendorf	3123000055	ピペッティングウイルス
ファインハサミ	ファインサイエンスツール	14059-11	湾曲した手術用ハサミ
フリードマン・ピアソン ロンゲールズ	ファインサイエンスツール	16121-14	椎弓切除術
ハルゼー ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12001-13	ニードルドライバー
インスリンシリンジ ウルトラファインニードル付き 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	シリンジ
イソフルラン	マッケッソン	803250	麻酔薬
イソプロパノール ワイプ	フィッシャー・サイエンティフィック	22-031-350	皮膚消毒
リドカイン、1%	マッケソン		239935 局所麻酔
微量遠心チューブ:1.5mL	フィッシャー・サイエンティフィ	05-408-137	シリンジの装填
ポビドンヨード	フィッシャーサイエンティフィック	50-118-0481	皮膚消毒
メスハンドル-#4	ファインサイエンスツール	10004-13	メスブレードホルダー
シュアシール誘導チャンバー	ブレインツリーサイエンティフィック	EZ-17	ボックス
外科用ブレードミルテックス炭素鋼No.11滅菌使い捨て個別包装	マッケソン	4-111	#11メスブレード
SYSTANENIGHTTIMEアイ軟膏	コン		アイ軟膏
トリパン			注射

棒 ック 麻酔アルブルーVWR97063-702