Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg
Summary
Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen für die Etablierung von Eierstockkrebs-Organoiden aus verschiedenen Krankheitsstadien und adressiert die Herausforderungen der patientenspezifischen Variabilität, um die Ausbeute zu erhöhen und eine robuste langfristige Expansion für nachfolgende Anwendungen zu ermöglichen. Es umfasst detaillierte Schritte für die Gewebeverarbeitung, die Aussaat, die Anpassung der Medienanforderungen und die Immunfluoreszenzfärbung.
Abstract
Während die Einrichtung einer Eierstockkrebs-Biobank aus patienteneigenen Organoiden zusammen mit ihren klinischen Hintergrundinformationen Fortschritte in der Forschung und Patientenversorgung verspricht, bleibt die Standardisierung aufgrund der Heterogenität dieser tödlichen Malignität in Kombination mit der inhärenten Komplexität der Organoidtechnologie eine Herausforderung. Dieses anpassungsfähige Protokoll bietet einen systematischen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung einer patientenspezifischen Variabilität der Vorläuferzellen auszuschöpfen. Durch die Implementierung eines strukturierten experimentellen Arbeitsablaufs zur Auswahl optimaler Kulturbedingungen und Seeding-Methoden mit parallelen Tests der direkten 3D-Seeding im Vergleich zu einer 2D/3D-Route erhalten wir in den meisten Fällen robuste, langfristig expandierende Linien, die für eine breite Palette von Downstream-Anwendungen geeignet sind.
Insbesondere wurde das Protokoll in einer großen Anzahl von Fällen (N = 120) mit sehr heterogenem Ausgangsmaterial, einschließlich hochgradigem und niedriggradigem Eierstockkrebs und Stadien der Erkrankung mit primärem Debulking, rezidivierender Erkrankung und postneoadjuvanten chirurgischen Proben, getestet und als wirksam erwiesen. In einer exogenen Umgebung mit niedrigem Wnt und hohem BMP beobachteten wir, dass Vorläuferzellen unterschiedlich anfällig für die Aktivierung des Heregulin 1 ß (HERß-1)-Signalwegs sind, wobei HERß-1 in einigen die Organoidbildung fördert, während sie in anderen gehemmt wird. Für eine Teilmenge der Patientenproben erfordern eine optimale Organoidbildung und ein langfristiges Wachstum die Zugabe von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und R-Spondin 1 zum Medium.
Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte der Gewebeverdauung und der Vorläuferisolierung hervor und weisen auf Beispiele hin, bei denen eine kurze Kultivierung in 2D auf Kunststoff für die anschließende Organoidbildung in der Basalmembranextrakt-Typ-2-Matrix von Vorteil ist. Insgesamt erfordert ein optimales Biobanking eine systematische parallele Prüfung aller Hauptbedingungen, um ein adäquates Wachstumsumfeld für einzelne Sparten zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt auch das Handhabungsverfahren für effizientes Einbetten, Schneiden und Färben, um hochauflösende Bilder von Organoiden zu erhalten, die für eine umfassende Phänotypisierung erforderlich sind.
Introduction
Die klinische Behandlung von Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom bleibt aufgrund des heterogenen klinischen Erscheinungsbilds in fortgeschrittenen Stadien und der hohen Rezidivrateneine Herausforderung 1. Um die Entwicklung und das biologische Verhalten von Eierstockkrebs besser zu verstehen, sind Forschungsansätze erforderlich, die sich mit der patientenspezifischen Variabilität im Krankheitsverlauf, dem Ansprechen auf die Behandlung und den histopathologischen sowie molekularen Merkmalen befassen2.
Biobanking, das sich durch die systematische Sammlung und Langzeitkonservierung von Tumorproben von Eierstockkrebspatientinnen zusammen mit ihren klinischen Informationen auszeichnet, bietet die Erhaltung einer großen Patientenkohorte in verschiedenen Krankheitsstadien, einschließlich Tumorproben aus primären Debulking-Operationen, nach neoadjuvanter Chemotherapie und nach rezidivierenden Erkrankungen. Es birgt wertvolles Potenzial für die Weiterentwicklung der Krebsforschung und dient als Ressource für vielversprechende prognostische Biomarker und therapeutische Ziele3. Herkömmliche Biobanking-Methoden wie Formalinfixierung und Einfrieren sind jedoch aufgrund des Verlusts der Lebensfähigkeit und der Störung der nativen dreidimensionalen Gewebearchitektur nicht für die Durchführung funktioneller Studien an den ursprünglichen Tumorproben geeignet 4,5.
Studien zu molekularen Mechanismen in der Onkologie und darüber hinaus hängen entscheidend von der Verwendung geeigneter experimenteller Modelle ab, die die Biologie der Krankheit getreu widerspiegeln und die in vitro Eigenschaften des in vivo beobachteten Gewebes beibehalten. Von Patienten stammende Organoide, die auf der Erhaltung des Erneuerungspotenzials basieren, reproduzieren im Labor die ursprüngliche Struktur und Funktion des Epithels und ermöglichen Tests in einem patientenspezifischen Kontext. Daher haben sie sich als vielversprechende Werkzeuge für die Krebsforschung und die personalisierte Medizin erwiesen, die die Lücke zwischen klinischer Vielfalt und Laborforschung schließen 6,7,8,9. Maßgeschneiderte therapeutische Strategien, die auf individuellen Wirkstoffreaktionen von Organoidlinien und der Prüfung der funktionellen Relevanz molekularer Profile basieren, können möglicherweise direkt auf die Patientenversorgung angewendet werden10,11. Die Möglichkeit der langfristigen Kultivierung unter Einbeziehung patientenspezifischer Merkmale und der Sammlung relevanter prospektiver klinischer Daten im Laufe der Zeit ist vielversprechend, um neue prognostische und prädiktive Faktoren zu identifizieren, die an der Krankheitsprogression und den Resistenzmechanismen beteiligt sind 3,9.
Der Aufbau einer Biobank, die Organoide aus verschiedenen Tumorproben enthält, erfordert jedoch eine Kombination aus strikter Einhaltung komplexer Methoden und der Einrichtung von Protokollen für eine einfache Wartung12. Die Prozessstandardisierung stellt sicher, dass die Biobank auch bei hohem Umsatz effizient von geschultem Personal aufgebaut und gepflegt werden kann und gleichzeitig höchste Qualitätsstandards eingehalten werden13. Mehrere Studien berichteten über die erfolgreiche Erzeugung stabiler Ovarialkarzinom-Organoidlinien, die dem Mutations- und phänotypischen Profil des ursprünglichen Tumors mit unterschiedlichen Effizienzraten entsprechen. Dennoch bleibt das routinemäßige Biobanking in der Praxis eine Herausforderung, insbesondere für ein langfristig stabiles Wachstum der Linien, das eine Voraussetzung für eine groß angelegte Expansion oder eine erfolgreiche Genomeditierung ist.
Insbesondere das Problem der Erweiterbarkeit bleibt in der Praxis vage definiert, da Organoide, die ein langsames und begrenztes Wachstumspotenzial aufweisen, gelegentlich als etablierte Linien gezählt werden. Wie ursprünglich von Hoffmann et al. gezeigt, einer Studie, deren Hauptergebnisse die Grundlage für dieses weiterentwickelte Protokoll bildeten, erfordert der optimale Umgang mit Eierstockkrebsgewebe eine einzigartige Strategie, um der Heterogenität Rechnung zu tragen14. Die phänotypische Charakterisierung der mit dieser Methode erhaltenen Organoide und die enge Ähnlichkeit mit dem elterlichen Tumorgewebe wurden durch Panel-DNA-Sequenzierung und Transkriptomik-Analyse reifer Kulturen (4-10 Monate Kultivierung) bestätigt, was die Stabilität des Modellsbelegt 8,9,12,14.
Im Gegensatz zur parakrinen Umgebung, die die Homöostase in den gesunden Eileitern reguliert, ist die Epithelschicht, die wahrscheinlich hochgradigen serösen Ovarialkrebs (HGSOC), das Krebsregenerationspotenzial und die Organoidbildungskapazität hervorbringt, weniger abhängig von einer exogenen Wnt-Supplementierung. Darüber hinaus erwies sich die aktive Signalgebung des Bone Morphogenetic Protein (BMP), die durch das Fehlen von Noggin im Organoidmedium gekennzeichnet ist, als vorteilhaft für die Etablierung von Langzeitkulturen aus festen Gewebeablagerungen von Eierstockkrebs14,15. Während des systematischen Biobankings von festen Ablagerungen von Eierstockkrebs haben wir diese Ergebnisse bestätigt und die Pipeline eingerichtet, wobei die Details in diesem Protokoll beschrieben sind, die in den meisten Fällen eine nachhaltige langfristige Expansion gewährleisten. Wir stellen fest, dass parallele Tests verschiedener Medienzusammensetzungen und Aussaatmodalitäten bei der Arbeit mit primären Isolaten unerlässlich sind, um die Etablierung langzeitstabiler Organoidlinien zu verbessern und die Ausbeute zu erhöhen, die eine robuste Vermehrung und Erweiterung auf Multiwell-Formate ermöglicht, die für nachgelagerte Experimente erforderlich sind16.
Darüber hinaus sind die Reinheit und Qualität der während der Operation entnommenen Proben von entscheidender Bedeutung für das translationale Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden in der Grundlagenforschung und molekularen Diagnostik. Die Komplexität der klinischen Präsentation von HGSOC erfordert eine enge Zusammenarbeit zwischen den Chirurgen, Onkologen und den Wissenschaftlern im Labor, um sicherzustellen, dass relevantes Material korrekt identifiziert, die Transportbedingungen konstant gehalten und Organoidlinien mit hoher Effizienz erzeugt werden, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit jedes Patienten darstellen. Dieses Protokoll bietet einen standardisierten, aber anpassungsfähigen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung der Heterogenität zu erfassen, die Eierstockkrebs charakterisiert16,17. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll ein zuverlässiges Biobanking des breiten Spektrums des klinischen Erscheinungsbildes von Eierstockkrebs, einschließlich verschiedener histologischer Typen (hochgradiger und niedriggradiger Eierstockkrebs, LGSOC), verschiedener Ablagerungen von denselben Patientinnen, die Unterschiede in der Stammzellregulation aufweisen, Gewebe von Operationen in postneoadjuvanter Umgebung, Biopsiematerial und Proben von Operationen in der rezidivierenden Phase des Krankheitsverlaufs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das entworfene Protokoll adressiert frühere Herausforderungen des Biobankings von Ovarialkarzinom-Organoiden in Bezug auf die Organoidbildung und das langfristige Passagepotenzial und stellt die Generierung vollständig expandierbarer Linien aus der Mehrheit der soliden Tumorablagerungen sicher. Der chirurgische Entnahmeprozess von Tumorproben, die für die Organoiderzeugung verwendet werden sollen, wirkt sich erheblich auf die Ausbeute und das Expansionspotenzial aus. Tumorgewebeproben können während verschiedener Ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gefördert wird die Studie vom Deutschen Krebsforschungszentrum DKTK, Partnerstandort München, einer Partnerschaft zwischen dem DKFZ und dem Universitätsklinikum LMU München. Die Studie wird auch durch die Deutsche Krebshilfe (#70113426 und #70113433) unterstützt. Die Paraffineinbettung von Gewebe und Organoiden wurde an der Core Facility des Instituts für Anatomie der Medizinischen Fakultät der LMU München, München, durchgeführt. Die konfokale Bildgebung wurde in der Core Facility Bioimaging am Biomedical Center (BMC) durchgeführt. Die Autoren danken Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink und Martina Rahmeh für die technische Hilfe.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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