Estratégia para Biobanco de Organoides para Câncer de Ovário: Abordando a Heterogeneidade Interpaciente entre Subtipos Histológicos e Estágios da Doença

Summary

Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.

Abstract

Embora o estabelecimento de um biobanco de câncer de ovário a partir de organoides derivados de pacientes, juntamente com suas informações de antecedentes clínicos, prometa avanços na pesquisa e no cuidado ao paciente, a padronização permanece um desafio devido à heterogeneidade dessa malignidade letal, combinada com a complexidade inerente da tecnologia organoide. Este protocolo adaptável fornece uma estrutura sistemática para realizar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando uma variabilidade paciente-específica de progenitores. Ao implementar um fluxo de trabalho experimental estruturado para selecionar condições ideais de cultura e métodos de semeadura, com testes paralelos de semeadura 3D direta versus uma rota 2D/3D, obtemos, na maioria dos casos, linhas de expansão robustas de longo prazo adequadas para uma ampla gama de aplicações downstream.

Notavelmente, o protocolo tem sido testado e se mostrado eficiente em um grande número de casos (N = 120) de material de partida altamente heterogêneo, incluindo câncer de ovário de alto e baixo grau e estádios da doença com debulking primário, doença recorrente e espécimes cirúrgicos pós-neoadjuvantes. Dentro de um ambiente de sinalização exógena de baixo Wnt e alto BMP, observamos progenitores sendo diferentemente suscetíveis à ativação da via da Heregulina 1 ß (HERß-1), com o HERß-1 promovendo a formação de organoides em alguns enquanto o inibe em outros. Para um subconjunto das amostras do paciente, a formação ideal de organoides e o crescimento a longo prazo requerem a adição do fator de crescimento de fibroblastos 10 e R-Spondin 1 ao meio.

Além disso, destacamos as etapas críticas da digestão do tecido e do isolamento do progenitor e apontamos exemplos em que o breve cultivo em 2D em plástico é benéfico para a subsequente formação de organoides na matriz do Extrato de Membrana Basal tipo 2. Em geral, o biobanco ideal requer testes sistemáticos de todas as principais condições em paralelo para identificar um ambiente de crescimento adequado para linhas individuais. O protocolo também descreve o procedimento de manuseio para incorporação, secção e coloração eficientes para obter imagens de alta resolução de organoides, o que é necessário para uma fenotipagem abrangente.

Introduction

O manejo clínico de pacientes com câncer epitelial de ovário permanece desafiador devido à sua apresentação clínica heterogênea em estágios avançados e altas taxas de^{recorrência1}. Melhorar nossa compreensão do desenvolvimento do câncer de ovário e do comportamento biológico requer abordagens de pesquisa que abordem a variabilidade específica do paciente durante o curso da doença, a resposta ao tratamento e as características histopatológicas e moleculares².

O biobanco, caracterizado pela coleta sistemática e preservação a longo prazo de amostras tumorais derivadas de pacientes com câncer de ovário, juntamente com suas informações clínicas, oferece a preservação de uma grande coorte de pacientes em diferentes estágios da doença, incluindo amostras tumorais de cirurgias primárias de citor, após quimioterapia neoadjuvante e de doença recorrente. Possui um potencial valioso para o avanço da pesquisa do câncer, servindo como um recurso de promissores biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos³. Entretanto, os métodos convencionais de biobanco, como fixação e congelamento de formalina, não são passíveis de estudos funcionais nas amostras tumorais originais devido à perda de viabilidade e à ruptura da arquitetura tecidual tridimensional^nativa4,5.

Estudos de mecanismos moleculares, em oncologia e fora dela, dependem crucialmente da utilização de modelos experimentais apropriados que reflitam fielmente a biologia da doença e mantenham as propriedades in vitro do tecido observado in vivo. Os organoides derivados do paciente, baseados na preservação do potencial de renovação, reproduzem em laboratório a estrutura e a função originais do epitélio e permitem o teste em um contexto específico do paciente. Portanto, eles têm emergido como ferramentas altamente promissoras para a pesquisa do câncer e medicina personalizada, fazendo a ponte entre a diversidade clínica e a pesquisa laboratorial6,7,8,9. Estratégias terapêuticas adaptadas, baseadas em respostas individuais a drogas de linhagens organoides e testes da relevância funcional de perfis moleculares, podem potencialmente ser aplicadas diretamente ao cuidado do paciente^10,11. A possibilidade de cultivo em longo prazo, incluindo características específicas do paciente e a coleta de dados clínicos prospectivos relevantes ao longo do tempo, é uma grande promessa para identificar novos fatores prognósticos e preditivos envolvidos na progressão da doença e nos mecanismos de resistência ^3,9.

No entanto, a construção de um biobanco que inclua organoides de diferentes amostras tumorais requer uma combinação de estrita adesão à metodologia complexa e estabelecimento de protocolos de fácil^{manutenção12}. A padronização do processo garante que o biobanco possa ser estabelecido e mantido de forma eficiente por pessoal treinado, mesmo em alta rotatividade, ao mesmo tempo em que adere aos mais altos padrões de qualidade¹³. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de linhagens organoides estáveis de câncer de ovário correspondentes ao perfil mutacional e fenotípico do tumor original com taxas de eficiência variáveis. Ainda assim, o biobanco de rotina continua desafiador na prática, particularmente para o crescimento estável de longo prazo das linhas, que é um pré-requisito para expansão em grande escala ou edição genômica bem-sucedida.

Em particular, a questão da expansibilidade permanece vagamente definida no campo, pois organoides que apresentam potencial de crescimento lento e limitado são ocasionalmente contados como linhas estabelecidas. Como demonstrado inicialmente por Hoffmann et al., um estudo cujos principais achados forneceram a base para esse protocolo mais desenvolvido, o manuseio ideal do tecido do câncer de ovário requer uma estratégia única para acomodar a heterogeneidade¹⁴. A caracterização fenotípica dos organoides obtidos por este método e a estreita similaridade com o tecido tumoral parental foram confirmadas por sequenciamento de DNA em painel e análise transcriptômica de culturas maduras (4-10 meses de cultivo), demonstrando a estabilidade do modelo8,9,12,14.

Em contraste com o ambiente parácrino que regula a homeostase nas tubas uterinas saudáveis, a camada epitelial, que provavelmente produz câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC), potencial de regeneração do câncer e capacidade de formação de organoides, é menos dependente da suplementação exógena de Wnt. Além disso, a sinalização ativa da Proteína Morfogenética Óssea (BMP), caracterizada pela ausência de Noggin em meio organoide, mostrou-se benéfica para o estabelecimento de culturas de longo prazo a partir de depósitos de tecido sólido de câncer de^ovário14,15. Durante o biobanco sistemático de depósitos sólidos de câncer de ovário, confirmamos esses achados e montamos o pipeline, com detalhes delineados neste protocolo que garante uma expansão sustentada a longo prazo na maioria dos casos. Descobrimos que testes paralelos de diferentes composições de meios e modalidades de semeadura quando se trabalha com isolados primários são essenciais para melhorar o estabelecimento de linhagens organoides estáveis a longo prazo e aumentar a produtividade, permitindo propagação e expansão robustas para formatos de poços múltiplos necessários para experimentos a jusante¹⁶.

Além disso, a pureza e a qualidade das amostras coletadas durante a cirurgia são de importância crucial para o potencial translacional dos organoides do câncer de ovário na pesquisa básica e no diagnóstico molecular. A complexidade da apresentação clínica do HGSOC requer uma estreita cooperação entre os cirurgiões, oncologistas e os cientistas do laboratório para garantir que o material relevante seja corretamente identificado, as condições de transporte sejam mantidas constantes e as linhas organoides sejam geradas com alta eficiência, representando as características mais importantes da doença de cada paciente. Este protocolo fornece uma estrutura padronizada, mas adaptável, para capturar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando a heterogeneidade que caracteriza o câncer de^ovário16,17. Notavelmente, este protocolo permite um biobanco confiável do amplo espectro de apresentação clínica do câncer de ovário, incluindo diferentes tipos histológicos (câncer de ovário de alto e baixo grau, LGSOC), diferentes depósitos das mesmas pacientes que exibem diferenças na regulação do tronco, tecidos de cirurgias em cenário pós-neoadjuvante, material de biópsia e amostras de cirurgias na fase recorrente de progressão da doença.

Protocol

Espécimes de tecido tumoral de cirurgias de câncer de ovário foram coletados e organoides derivados da paciente foram gerados em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade LMU (17-471), aderindo aos regulamentos existentes aplicáveis da UE, nacionais e locais. Cada paciente envolvido no estudo consentiu por escrito. Ao trabalhar com amostras de tecido fresco, a permissão de segurança de Nível 2 de Biossegurança e os gabinetes de fluxo laminar são necessários. Dada a natureza potencialmente infecciosa …

Representative Results

Após dissociação, filtração e contagem inicial do tecido, as células são semeadas em paralelo diretamente no formato 3D, como explicado acima, bem como a suspensão no frasco para breve expansão 2D. Em alguns casos, a expansão 2D transitória influencia positivamente a formação do organoide, e a linha de longo prazo é estabelecida com sucesso por essa via, enquanto a semeadura 3D paralela comparativa pode resultar em parada de crescimento (Figura 1). Para cada tecido doador proce…

Discussion

O protocolo projetado aborda os desafios anteriores do biobanco de organoides do câncer de ovário no que diz respeito à formação de organoides e ao potencial de passagem a longo prazo e garante a geração de linhas totalmente expansíveis a partir da maioria dos depósitos tumorais sólidos. O processo de coleta cirúrgica de amostras tumorais a serem utilizadas para geração de organoides impacta significativamente o rendimento e o potencial de expansão. Amostras de tecido tumoral podem ser obtidas durante vári…

Materials

100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001