Her beskriver vi en procedure, der muliggør organdækkende påvisning af patogene bakterier under infektion og kvantificering af fluorescerende reporteraktiviteter.
De fleste infektioner finder sted i tredimensionelt værtsvæv med indviklet anatomi og lokalt varierende værtsfysiologi. Placeringen af patogenceller i dette forskelligartede miljø påvirker i høj grad deres stressniveauer, responser, skæbne og bidrag til den samlede progression af sygdommen og behandlingssvigt. På grund af de tekniske vanskeligheder med at lokalisere μm-store patogenceller i cm-store værtsorganer har dette forskningsområde imidlertid været relativt uudforsket. Her præsenterer vi en metode til at løse denne udfordring. Vi anvender seriel to-fotontomografi og AI-forbedret billedanalyse til at lokalisere individuelle Salmonella-celler gennem hele milten, leverlapperne og hele lymfeknuderne hos inficerede mus. Ved hjælp af fluorescerende reportere og in vivo antistofadministration kan replikationshastigheden af enkelte Salmonella-celler , deres lokale interaktion med specifikke immunceller og bakterielle reaktioner på antibiotika bestemmes. Disse metoder åbner muligheder for en omfattende undersøgelse af infektioner, deres forebyggelse og behandling inden for den tredimensionelle vævskontekst.
Infektioner forekommer i væv med kompleks anatomi og kompartmentopdelt fysiologi. De forskellige mikromiljøer, der sameksisterer i det inficerede væv, kan bestemme skæbnen for lokale patogenundergrupper og deres bidrag til det samlede sygdomsudfald 1,2,3. Omfattende 3D-kortlægning af mikrobielle patogener i væv i cm-størrelse er dog fortsat udfordrende4. Billeddannelse af hjernen og andre organer er et meget aktivt forskningsfelt med konstant forbedrede eksperimentelle strategier5, men mange metoder mangler stadig den sub-μm-opløsning, der ville være nødvendig for at identificere μm-store bakterielle patogener med sikkerhed. I modsætning hertil muliggør seriel to-foton (STP) tomografi6 automatiseret flerfarvet, deformationsfri billeddannelse af hele væv med sub-μm opløsning i planet, hvilket giver fulde volumetriske datasæt. Denne metode kombinerer gentagen fysisk sektionering af vævet ved hjælp af et vibratom med intermitterende to-foton-billeddannelse af de nye blokflader med infrarødt lys. STP-tomografi er blevet brugt i vid udstrækning til kortlægning af tynde axoner i hjernen for at etablere forbindelseskort 7,8,9,10.
STP-tomografi muliggør også 3D-kortlægning af individuelle mikrobielle patogenceller (Salmonella, Toxoplasma) i hele det inficerede væv11,12 ved hjælp af en tomograf. Anden-harmonisk generering afslører kollagenskeder omkring arterier og i fibrøse bånd såsom miltens trabekler, hvilket giver anatomisk kontekst. In vivo injicerede fluorescerende antistoffer kan bruges til at farve værtsceller for at afsløre interaktioner mellem individuelle patogenceller og infiltrerende immunceller såsom neutrofiler. Her beskrives pipelinen, der involverer bearbejdning af vævet, billeddannelse, sammenføjning af billedfliser med belysningskorrektion, stabling af billeder i tre dimensioner og segmentering ved hjælp af maskinlæringsværktøjer. Denne pipeline giver 3D-positioner af individuelle patogener, celler og mikrokolonier inden for deres værtskontekst. Det er fortsat vanskeligt at tælle antallet af individuelle celler i mikrokolonier på grund af opløsningsgrænser, men sådanne tal kan estimeres baseret på mikrokoloniens integrerede lysstyrke. Rørledningen kan let tilpasses til andre infektionsmodeller, hvis rekombinante GFP- eller YFP-udtrykkende patogener er tilgængelige.
Den lokale vævskontekst af bakterielle patogener er afgørende for at bestemme lokale værtsangreb, bakterielle tilpasninger, det lokale resultat af værtspatogeninteraktioner og antimikrobiel kemoterapi og de individuelle bidrag til det samlede sygdomsresultat. Det har været en udfordring at afbilde bakterier på størrelse med mikrometer i centimeterstore organer. Seriel to-foton (STP) tomografi giver tilstrækkelig rumlig opløsning til at detektere individuelle bakterieceller i hele organer, automatiseret snitning og billeddannelse og tilstrækkelig gennemstrømning (~1 organ pr. dag)11. Mens værtsantigener kan farves in vivo, bør patogenceller udtrykke egnede fluorescerende proteiner for at sikre omfattende påvisning af intracellulære patogenceller. De resulterende datasæt (0,5-1,5 TeraByte pr. organ) udgør betydelige udfordringer for it-infrastrukturer til dataanalyse og lagring.
Der er flere kritiske trin i denne metode. For det første kræves en patogenstamme med påviselig og homogen ekspression af fluorescerende protein GFP eller YFP. Ideelt set bruges en kromosomal ekspressionskassette25 til at minimere fluorescensheterogenitet på grund af plasmidkopinummervariation. Tilstrækkelig fluorescensintensitet er påkrævet, men for høje niveauer af fluorescerende protein bør undgås for at undgå konditionsforringelse af patogenet23. Passende ekspressionsniveauer kan opnås ved valg af en passende promotor og finjustering af det ribosomale bindingssted25 eller hele det 5′ utranslaterede område (UTR)26. For det andet bør perfusionsfikseringen involvere en indledende vask med buffer for at fjerne så mange erytrocytter som muligt fra blodcirkulationen. Dette er især kritisk for milt og lever (selvom fuldstændig fjernelse af erytrocytter fra disse organer er vanskelig). Resterende erytrocytter absorberer lys i den synlige del af spektret, hvilket kompromitterer billedkvaliteten27. For det tredje er opbevaring af det faste væv i kryobeskyttelsesmidlet afgørende for at reducere vævsautofluorescens, som er særlig høj i betændt væv og kan overskygge den forholdsvis svage fluorescens af patogencellerne11. For det fjerde er den effektive tværbinding af vævet til den omgivende agaroseblok afgørende for glat vibratomskæring, uden at vævet springer ud af agaroseblokken. For det femte skal fluorescerende signaler og deres identifikation som patogenceller verificeres uafhængigt ved hjælp af ortogonale tilgange såsom farvning med antistoffer mod patogenkomponenter (såsom lipopolysaccharid for gramnegative bakterier) og konfokalmikroskopi af sektionerne hentet fra tomografen11. Nogle inficerede væv indeholder autofluorescerende partikler med lignende form og overlappende fluorescensspektre, der let kan misforstås som patogenceller. For det sjette bør mængden af patogenceller i mikrokolonier sammenlignes med ortogonale tilgange såsom konfokalmikroskopi for at vurdere nøjagtigheden. De samlede bakteriebelastninger baseret på disse beregninger bør verificeres ved sammenligning med ortogonale tilgange såsom flowcytometri og plettering.
Vigtige ændringer af den udbredte STP-protokol inkluderer placering af et smalt båndpasfilter 510/20 nm foran fotomultiplikator 211 for at reducere interferens af grøn-gul autofluorescens, der er særlig stærk i inficeret og betændt lever, milt og Peyers pletter. Den stærke autofluorescens og øgede lysspredning af sådanne organer sammenlignet med hjernen (som dominerer andre anvendelser af STP) genererer også et behov for mere effektiv korrektion for ujævn belysning. Som en anden modifikation anvender denne protokol CIDRE-tilgangen22 til dette formål (figur 3) og AI-baseret segmentering af bakterier. Endelig blev vævsforbehandling ændret ved at inkludere et inkubationstrin i kryobeskyttelsesmiddel ved -20 °C, hvilket reducerer vævsautofluorescens og dermed letter påvisning af små patogenceller med relativt svag fluorescens11.
Fejlfinding kan være nødvendig, hvis ingen patogensignaler kan detekteres, eller segmentering giver utilstrækkelig følsomhed (for mange patogenceller overses) eller utilstrækkelig præcision (for mange baggrundspartikler segmenteres som patogenceller). Hvis autofluorescens i baggrundsvæv kan påvises, men der er for få patogensignaler, kan patogenerne indeholde utilstrækkelige mængder fluorescerende proteiner. Dette kan testes ved hjælp af konfokalmikroskopi af vævssnit fra samme inficerede væv eller flowcytometri af vævshomogenater19,28. Underliggende årsager kan være utilstrækkelige ekspressionsniveauer eller ustabilitet af ekspressionskassetten. Afbødningsstrategier kan omfatte alternative promotorer til at drive ekspression, kodontilpasning af de gener, der koder for det fluorescerende protein for patogenarten, anvendelse af episomale konstruktioner med højere kopiantal eller stabilisering af ekspressionskassetter ved kromosomintegration eller balanceret-dødelig komplementering29. Valget af fluorescerende protein er også vigtigt, men detektion er mulig med GFP.mut2, mWasabi, YPet og TIMERbac. Hvis segmenteringen er unøjagtig, kan dette være forårsaget af for svag patogenfluorescens, som kan behandles som beskrevet ovenfor, eller for høj vævsautofluorescensbaggrund. Omfattende perfusion af vaskeopløsning eller langvarig inkubation i opbevaringsbuffer umiddelbart før indlejring i agaroseblokken og tomografi kan løse disse problemer. Endelig kræves tilstrækkelig træning af det neurale netværk til præcis klassificering, men overdreven træning kan føre til overtilpasning, der forringer ydeevnen for nye prøver.
I øjeblikket kan ingen anden metode afbilde hele organer med tilstrækkelig rumlig opløsning i 3D til at detektere individuelle bakterier. Fremtidige forbedringer inden for vævsrensning og lysarkmikroskopi kan opnå en lignende opløsning. Dette kan muliggøre billeddannelse ved højere hastighed og med mere fluorescerende kanaler.
En vigtig begrænsning ved STP er pixelopløsningen i planet på ~0,5 μm og den vertikale opløsning på 5 til 10 μm, hvilket er utilstrækkeligt til at opløse tæt placerede bakterier, f.eks. inden for en tætpakket mikrokoloni. Det er dog muligt at hente vævssnit efter tomografi til sekundær højopløselig konfokalmikroskopi af udvalgte vævsdele. En anden begrænsning ved STP er tilgængeligheden af kun tre fluorescenskanaler, hvilket begrænser antallet af fluoroforer, der kan afbildes samtidigt. Igen kan sekundær analyse af udhentede vævssnit med multiplexing-metoder afsløre placeringen og intensiteten af mange flere markører for udvalgte vævsdele. Disse oplysninger kan integreres i den overordnede 3D-struktur af det omgivende væv som bestemt med STP.
Afslutningsvis muliggør denne protokol detaljerede undersøgelser af vært-patogen-interaktioner på lokalt og helorganniveau. Protokollen skal let kunne tilpasses andre patogener (forudsat at de kan fås som fluorescerende stammer), andre organer og forskellige værtsarter.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 og NCCR_ 180541 AntiResist (til DB).
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
.