यहां, हम एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो संक्रमण के दौरान रोगजनक बैक्टीरिया के अंग-व्यापी पता लगाने और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर गतिविधियों की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है।
अधिकांश संक्रमण जटिल शरीर रचना विज्ञान और स्थानीय रूप से भिन्न मेजबान शरीर विज्ञान के साथ त्रि-आयामी मेजबान ऊतकों के भीतर होते हैं। इस विविध वातावरण के भीतर रोगज़नक़ कोशिकाओं की स्थिति उनके तनाव के स्तर, प्रतिक्रियाओं, भाग्य और रोग और उपचार की विफलता की समग्र प्रगति में योगदान को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। हालांकि, सेमी-आकार के मेजबान अंगों के भीतर माइक्रोन आकार के रोगज़नक़ कोशिकाओं का पता लगाने में तकनीकी कठिनाइयों के कारण, अनुसंधान का यह क्षेत्र अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत रहा है। यहां, हम इस चुनौती को संबोधित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हम पूरे प्लीहा, यकृत लोब और संक्रमित चूहों के पूरे लिम्फ नोड्स में व्यक्तिगत साल्मोनेला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सीरियल दो-फोटॉन टोमोग्राफी और एआई-वर्धित छवि विश्लेषण को नियोजित करते हैं। फ्लोरोसेंट पत्रकारों और विवो एंटीबॉडी प्रशासन में उपयोग करना, एकल साल्मोनेला कोशिकाओं की प्रतिकृति दर, विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी स्थानीय बातचीत, और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए जीवाणु प्रतिक्रियाएं निर्धारित की जा सकती हैं। ये पद्धतियां तीन आयामी ऊतक संदर्भ के भीतर संक्रमण, उनकी रोकथाम और उपचार की व्यापक परीक्षा के लिए रास्ते खोलती हैं।
संक्रमण जटिल शरीर रचना विज्ञान और कम्पार्टमेंटल शरीर विज्ञान के साथ ऊतकों में होता है। संक्रमित ऊतक में सह-अस्तित्व कि विविध microenvironments स्थानीय रोगज़नक़ सबसेट के भाग्य और समग्र रोगपरिणाम 1,2,3 के लिए उनके योगदान निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि, सेमी आकार के ऊतकों में माइक्रोबियल रोगजनकों के व्यापक 3 डी मानचित्रण चुनौतीपूर्ण 4 बनी हुईहै. मस्तिष्क और अन्य अंगों की इमेजिंग लगातार प्रयोगात्मक रणनीतियों5 में सुधार के साथ एक अत्यधिक सक्रिय अनुसंधान क्षेत्र है, लेकिन कई तरीकों में अभी भी उप-माइक्रोन संकल्प की कमी है जो माइक्रोन आकार के जीवाणु रोगजनकों को आत्मविश्वास से पहचानने के लिए आवश्यक होगा। इसके विपरीत, सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी6 स्वचालित बहु-रंग, उप-माइक्रोन इन-प्लेन रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे ऊतकों की विरूपण-मुक्त इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे पूर्ण वॉल्यूमेट्रिक डेटासेट प्राप्त होते हैं। यह विधि अवरक्त प्रकाश के साथ उभरते ब्लॉक चेहरों के आंतरायिक दो-फोटॉन इमेजिंग के साथ एक कंपन का उपयोग करके ऊतक के बार-बार भौतिक सेक्शनिंग को जोड़ती है। एसटीपी टोमोग्राफी व्यापक रूप से कनेक्टिविटी नक्शे 7,8,9,10 स्थापित करने के लिए मस्तिष्क में पतली अक्षतंतु मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है.
एसटीपी टोमोग्राफी भी एक टोमोग्राफ का उपयोग कर पूरे संक्रमित ऊतकों11,12 में व्यक्तिगत माइक्रोबियल रोगज़नक़ कोशिकाओं (साल्मोनेला, टोक्सोप्लाज्मा) के 3 डी मानचित्रण सक्षम बनाता है. दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी धमनियों के चारों ओर और तिल्ली के ट्रेबेकुले जैसे रेशेदार बैंड में कोलेजन म्यान को प्रकट करती है, इस प्रकार शारीरिक संदर्भ प्रदान करती है। विवो इंजेक्शन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी में व्यक्तिगत रोगज़नक़ कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए मेजबान कोशिकाओं को दागने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, ऊतक के प्रसंस्करण, इमेजिंग, रोशनी सुधार के साथ इमेजिंग टाइल्स की सिलाई, तीन आयामों में छवियों के स्टैकिंग, और मशीन-लर्निंग टूल का उपयोग करके विभाजन से जुड़ी पाइपलाइन का वर्णन किया गया है। यह पाइपलाइन अपने मेजबान संदर्भ के भीतर व्यक्तिगत रोगजनकों कोशिकाओं और माइक्रोकॉलोनियों की 3 डी स्थिति पैदा करती है। माइक्रोकॉलोनियों के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की संख्या की गणना संकल्प सीमा के कारण मुश्किल बनी हुई है, लेकिन माइक्रोकॉलोनी की एकीकृत चमक के आधार पर ऐसी संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है। पाइपलाइन को अन्य संक्रमण मॉडल के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है यदि पुनः संयोजक जीएफपी- या वाईएफपी-व्यक्त रोगजनक उपलब्ध हैं।
बैक्टीरियल रोगजनकों का स्थानीय ऊतक संदर्भ स्थानीय मेजबान हमलों, जीवाणु अनुकूलन, मेजबान रोगज़नक़ इंटरैक्शन और रोगाणुरोधी कीमोथेरेपी के स्थानीय परिणाम और समग्र रोग परिणाम में व्यक्तिगत योगदान को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेंटीमीटर आकार के अंगों में माइक्रोमीटर के आकार के बैक्टीरिया की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है। सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी पूरे अंगों, स्वचालित सेक्शनिंग और इमेजिंग, और पर्याप्त थ्रूपुट (~ 1 अंग प्रति दिन)11में व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान करती है। जबकि मेजबान एंटीजन को विवो में दाग दिया जा सकता है, रोगज़नक़ कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ कोशिकाओं का व्यापक पता लगाने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करना चाहिए। परिणामी डेटा सेट (0.5-1.5 टेराबाइट प्रति अंग) डेटा विश्लेषण और भंडारण के लिए आईटी इन्फ्रास्ट्रक्चर के लिए पर्याप्त चुनौतियां पेश करते हैं।
इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP या YFP का पता लगाने योग्य और सजातीय अभिव्यक्ति के साथ एक रोगज़नक़ तनाव की आवश्यकता है. आदर्श रूप से, एक गुणसूत्र अभिव्यक्ति कैसेट25 प्लास्मिड प्रतिलिपि संख्या भिन्नता के कारण प्रतिदीप्ति विषमता को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पर्याप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता की आवश्यकता है, लेकिन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अत्यधिक स्तर रोगज़नक़23 की फिटनेस हानि से बचने के लिए बचा जाना चाहिए. उपयुक्त अभिव्यक्ति स्तर एक उपयुक्त प्रमोटर के चयन और राइबोसोमल बाध्यकारी साइट25 या पूरे 5 ‘untranslated क्षेत्र (यूटीआर)26के ठीक-ट्यूनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. दूसरा, छिड़काव निर्धारण बफर के साथ एक प्रारंभिक धोने शामिल होना चाहिए रक्त परिसंचरण से संभव के रूप में कई एरिथ्रोसाइट्स को दूर करने के लिए. यह प्लीहा और यकृत के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (हालांकि इन अंगों से पूर्ण एरिथ्रोसाइट हटाना मुश्किल है)। शेष एरिथ्रोसाइट्स इमेजिंग गुणवत्ता27 समझौता स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग में प्रकाश अवशोषित. तीसरा, क्रायोप्रोटेक्टेंट में निश्चित ऊतकों का भंडारण ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस, जो विशेष रूप से सूजन वाले ऊतकों में उच्च है और रोगज़नक़ कोशिकाओं11 के तुलनात्मक रूप से कमजोर प्रतिदीप्ति की देखरेख कर सकता है, को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। चौथा, आसपास के agarose ब्लॉक के लिए ऊतक के प्रभावी पार जोड़ने ऊतक agarose ब्लॉक से बाहर कूद के बिना चिकनी थरथानेवाला काटने के लिए महत्वपूर्ण है. पांचवां, फ्लोरोसेंट संकेतों और रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में उनकी पहचान को रोगज़नक़ घटकों (जैसे ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड) के एंटीबॉडी के साथ धुंधला होना और टोमोग्राफ11 से प्राप्त वर्गों के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोण का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए। कुछ संक्रमित ऊतकों में समान आकार और अतिव्यापी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के साथ ऑटो-फ्लोरोसेंट कण होते हैं जिन्हें आसानी से रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में गलत समझा जा सकता है। छठा, माइक्रोकॉलोनियों के भीतर रोगज़नक़ कोशिकाओं की मात्रा की तुलना सटीकता का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोणों से की जानी चाहिए। इन गणनाओं के आधार पर समग्र जीवाणु भार को प्रवाह साइटोमेट्री और चढ़ाना जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोणों की तुलना में सत्यापित किया जाना चाहिए।
व्यापक रूप से इस्तेमाल किया एसटीपी प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण संशोधनों में हरे-पीले ऑटोफ्लोरेसेंस के हस्तक्षेप को कम करने के लिए फोटोमल्टीप्लायर 211 के सामने एक संकीर्ण बैंडपास फिल्टर 510/20 एनएम रखना शामिल है जो विशेष रूप से संक्रमित और सूजन वाले यकृत, प्लीहा और पीयर के पैच में मजबूत है। मस्तिष्क की तुलना में ऐसे अंगों के मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस और बढ़े हुए प्रकाश प्रकीर्णन (जो एसटीपी के अन्य अनुप्रयोगों पर हावी है) भी असमान रोशनी के लिए अधिक प्रभावी सुधार की आवश्यकता उत्पन्न करता है। एक और संशोधन के रूप में, यह प्रोटोकॉल इस उद्देश्य (चित्रा 3) और बैक्टीरिया के एआई-आधारित विभाजन के लिए सीआईडीआरई दृष्टिकोण22 को नियोजित करता है। अंत में, ऊतक प्रीप्रोसेसिंग को -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्टेंट में एक इनक्यूबेशन कदम शामिल करके बदल दिया गया था जो ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करता है और इस प्रकार अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिदीप्ति11 के साथ छोटे रोगज़नक़ कोशिकाओं का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।
समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है यदि कोई रोगज़नक़ संकेतों का पता नहीं लगाया जा सकता है, या विभाजन अपर्याप्त संवेदनशीलता (बहुत सारे रोगज़नक़ कोशिकाओं को याद किया जाता है) या अपर्याप्त परिशुद्धता (बहुत अधिक पृष्ठभूमि कणों को रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में खंडित किया जाता है) पैदा करता है। यदि पृष्ठभूमि ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस का पता लगाया जा सकता है, लेकिन बहुत कम रोगज़नक़ संकेत हैं, तो रोगजनकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अपर्याप्त मात्रा हो सकती है। यह एक ही संक्रमित ऊतक या ऊतक समरूप19,28 के प्रवाह साइटोमेट्री से ऊतक वर्गों के फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. अंतर्निहित कारण अपर्याप्त अभिव्यक्ति स्तर या अभिव्यक्ति कैसेट की अस्थिरता हो सकती है। शमन रणनीतियों में अभिव्यक्ति को चलाने के लिए वैकल्पिक प्रमोटर, रोगज़नक़ प्रजातियों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन का कोडन-अनुकूलन, उच्च प्रतिलिपि संख्या के साथ एपिसोमल निर्माणों का रोजगार, या गुणसूत्र एकीकरण या संतुलित-घातक पूरकता द्वारा अभिव्यक्ति कैसेट का स्थिरीकरण शामिल हो सकताहै। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चुनाव भी महत्वपूर्ण है, लेकिन GFP.mut2, mWasabi, YPet, और TIMERbac के साथ पता लगाना संभव है। यदि विभाजन गलत है, तो यह बहुत कमजोर रोगज़नक़ प्रतिदीप्ति के कारण हो सकता है जिसे ऊपर वर्णित के रूप में संबोधित किया जा सकता है, या बहुत अधिक ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि। धोने समाधान के व्यापक छिड़काव या तुरंत agarose ब्लॉक और टोमोग्राफी में एम्बेड करने से पहले भंडारण बफर में लंबे समय तक इनक्यूबेशन इन मुद्दों को हल हो सकता है. अंत में, सटीक वर्गीकरण के लिए तंत्रिका नेटवर्क के पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, लेकिन अत्यधिक प्रशिक्षण से ओवरफिटिंग हो सकती है जो नए नमूनों के लिए प्रदर्शन को बाधित करती है।
वर्तमान में, कोई अन्य विधि व्यक्तिगत बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए 3 डी में पर्याप्त स्थानिक संकल्प पर पूरे अंगों की छवि नहीं कर सकती है। ऊतक समाशोधन और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी में भविष्य में सुधार इसी तरह के संकल्प को प्राप्त हो सकता है. यह उच्च गति पर और अधिक फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ इमेजिंग सक्षम हो सकता है.
एसटीपी की एक महत्वपूर्ण सीमा ~ 0.5 माइक्रोन का इन-प्लेन पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन और 5 से 10 माइक्रोन का ऊर्ध्वाधर रिज़ॉल्यूशन है, जो घनी पैक वाली माइक्रोकॉलोनी के भीतर निकटता से स्थित बैक्टीरिया को हल करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, चयनित ऊतक भागों के माध्यमिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए टोमोग्राफी के बाद ऊतक वर्गों को पुनः प्राप्त करना संभव है। एसटीपी की एक और सीमा केवल तीन प्रतिदीप्ति चैनलों की उपलब्धता है, जो फ्लोरोफोर्स की संख्या को प्रतिबंधित करती है जिसे एक साथ चित्रित किया जा सकता है। फिर, बहुसंकेतन तरीकों के साथ पुनर्प्राप्त ऊतक वर्गों के माध्यमिक विश्लेषण चयनित ऊतक भागों के लिए कई और मार्करों के स्थान और तीव्रता प्रकट कर सकते हैं. इस जानकारी को एसटीपी के साथ निर्धारित आसपास के ऊतक की समग्र 3 डी संरचना में एकीकृत किया जा सकता है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल स्थानीय और पूरे अंग स्तर पर मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की विस्तृत जांच को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल आसानी से अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए (बशर्ते वे फ्लोरोसेंट उपभेदों के रूप में प्राप्त किया जा सकता है), अन्य अंगों, और विभिन्न मेजबान प्रजातियों.
The authors have nothing to disclose.
काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन 310030_156818, 310030_182315 और NCCR_ 180541 एंटीरेसिस्ट (डीबी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
.