Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin
Summary
Ici, nous fournissons une procédure pratique pour disséquer et effectuer des analyses histologiques et d’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin.
Abstract
La thermogenèse médiée par le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle important dans la régulation du métabolisme, et sa morphologie et sa fonction peuvent être grandement influencées par les stimuli environnementaux chez la souris et l’homme. Actuellement, la MTD interscapulaire murine (iBAT), qui est située entre deux omoplates dans le flanc dorsal supérieur des souris, est le principal dépôt de MTD utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier la fonction des MTD. Récemment, quelques dépôts de MTD jusqu’alors inconnus ont été identifiés chez la souris, dont un analogue au tissu adipeux brun supraclaviculaire humain. Contrairement à iBAT, le tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) est situé dans la couche intermédiaire du cou et n’est donc pas accessible aussi facilement.
Pour faciliter l’étude des scBAT de souris nouvellement identifiées, un protocole détaillant les étapes de dissection des scBAT intactes de souris postnatales et adultes est présenté. En raison de la petite taille du scBAT par rapport aux autres dépôts adipeux, les procédures ont été modifiées et optimisées spécifiquement pour le traitement du scBAT. Parmi ces modifications, il y a l’utilisation d’un microscope à dissection pendant le prélèvement de tissus pour augmenter la précision et l’homogénéisation des échantillons de scBAT congelés afin d’augmenter l’efficacité de l’analyse qPCR ultérieure. Grâce à ces optimisations, l’identification, l’apparence morphologique et la caractérisation moléculaire du scBAT peuvent être déterminées chez la souris.
Introduction
La prévalence croissante de l’obésité aux États-Unis et dans le monde a suscité un grand intérêt pour la compréhension de son étiologie et l’identification de traitements potentiels 1,2. Le tissu adipeux joue un rôle essentiel dans le métabolisme, et la dérégulation du tissu adipeux peut entraîner le développement de l’obésité. Généralement, il existe deux types de tissus adipeux, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) peut stocker de l’énergie chimique et sécréter des facteurs endocriniens, le tissu adipeux brun (BAT) peut utiliser l’énergie chimique pour générer de la chaleur et maintenir la température corporelle dans le froid 3,4. En raison de cette capacité unique, l’activation de la BAT peut également augmenter la dépense énergétique et améliorer la sensibilité à l’insuline5.
La MTD exerce sa fonction par thermogenèse sans frisson, un processus médié par le découplage de la protéine 1 (UCP1)6. Les mammifères, y compris les souris et les humains, possèdent des quantités variables de MTD. La vision classique de la MTD est que ces tissus adipeux sont plus abondants chez les souris et les nourrissons que chez les humains adultes. iBAT, situé dans le flanc dorsal supérieur entre les omoplates, est le dépôt de BAT le plus étudié chez la souris. En appliquant des tests d’imagerie radio-isotopique et de biopsie, des études récentes ont identifié plusieurs dépôts de MTD chez l’homme adulte. Certains d’entre eux, y compris les dépôts trouvés dans le cou profond et la région sus-claviculaire, n’avaient pas été identifiés auparavant chez la souris ou d’autres animaux modèles 7,8,9,10,11. Parmi ces dépôts MTD, le scBAT est le dépôt le plus fréquemment observé chez l’homme adulte. Pour mieux comprendre l’origine et la contribution moléculaire de ces dépôts BAT nouvellement découverts chez l’homme, il est essentiel d’identifier des dépôts équivalents chez la souris qui permettent des manipulations génétiques et moléculaires pour retracer et tester le rôle fonctionnel de ces dépôts. Ainsi, nous et d’autres avons identifié quelques dépôts BAT jusqu’alors inconnus dans différents emplacements anatomiques chez la souris, notamment scBAT12,13, thoracique périvasculaire BAT14,15, périrénal BAT16 et périaortique BAT17. Le scBAT de souris ressemble anatomiquement au scBAT humain et morphologiquement à l’iBAT classique, exprimant des niveaux élevés d’UCP112.
Contrairement à l’iBAT de souris, qui peut être facilement disséquée, la scBAT est située dans la couche intermédiaire du cou de la souris, sous les glandes salivaires et le long de la veine jugulaire externe. L’isolement de ce dépôt pour les analyses histologiques et moléculaires peut être difficile. Nous décrivons ici en détail la procédure de dissection des souris postnatales et adultes et le traitement de ce dépôt pour l’histologie et l’analyse de l’expression génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous présentons en détail les procédures de dissection et de traitement des scBAT pour les analyses H&E et d’expression génique. Comme le scBAT réside dans la couche intermédiaire du cou et se trouve le long des grosses veines, l’isolement de ce dépôt nécessite une technique précise. Plus précisément, pour avoir une vue claire du dépôt, nous recommandons de placer la souris sous un microscope à dissection après l’ouverture du cou. À l’aide d’une paire de pinces à pointe ultr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le NIDDK du NIH sous le numéro d’attribution R01DK116899, l’USDA/ARS sous le numéro d’attribution 3092-51000-064-000D et un prix pilote de l’Institut de recherche cardiovasculaire du Baylor College of Medicine. Les organigrammes ont été produits à l’aide de BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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