Диссекция, гистологическая обработка и анализ экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей
Summary
Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.
Abstract
Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.
Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.
Introduction
Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения 1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры телана холоде. Благодаря этой уникальной способности активация БАТ также может увеличить расход энергии и улучшить чувствительность к инсулину5.
BAT выполняет свою функцию посредством недрожащего термогенеза, процесса, опосредованного развязкой белка 1 (UCP1)6. Млекопитающие, в том числе мыши и люди, обладают разным количеством BAT. Классическая точка зрения БАТ заключается в том, что эти жировые ткани более распространены у мышей и младенцев, чем у взрослых людей. iBAT, расположенный в верхней дорсальной области между лопатками, является наиболее изученным депо BAT у мышей. Применяя радиоизотопную визуализацию и биопсийные тесты, недавние исследования выявили несколько депо БАТ у взрослых людей. Некоторые из них, в том числе депо, обнаруженные в глубокой шейке и надключичной области, ранее не были идентифицированы у мышей или других модельных животных 7,8,9,10,11. Среди этих депо BAT, scBAT является наиболее часто встречающимся депо у взрослых людей. Чтобы лучше понять происхождение и молекулярный вклад этих недавно обнаруженных депо BAT в организме человека, важно идентифицировать эквивалентные депо у мышей, которые позволяют генетическим и молекулярным манипуляциям отслеживать и тестировать функциональную роль этих депо. Таким образом, мы и другие ученые идентифицировали несколько ранее неизвестных депо BAT в различных анатомических местах у мышей, включая scBAT12,13, грудной периваскулярный BAT14,15, околопочечный BAT16 и периаортальный BAT17. Мышиный scBAT анатомически напоминает человеческий scBAT и морфологически напоминает классический iBAT, экспрессируя высокие уровни UCP112.
В отличие от мышиного iBAT, который легко поддается вскрытию, scBAT располагается в промежуточном слое шеи мыши, под слюнными железами и вдоль наружной яремной вены. Выделение этого депо для гистологического и молекулярного анализов может быть сложной задачей. Здесь мы подробно опишем процедуру препарирования scBAT у постнатальных и взрослых мышей и обработки этого депо для гистологии и анализа экспрессии генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое пред?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIDDK Национального института здравоохранения (NIH) под номером R01DK116899, Министерством сельского хозяйства США (USDA/ARS) под номером 3092-51000-064-000D и пилотной премией от Института сердечно-сосудистых исследований Медицинского колледжа Бэйлора. Блок-схемы были созданы с помощью BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
