构建人阴道芯片中的健康与菌群失调阴道微环境模型

摘要

本文介绍了一种用于构建微流控阴道芯片（Vagina Chip）培养装置的实验方案，该装置可在微需氧条件下研究人类宿主与活性阴道微生物组之间的相互作用。该芯片可作为研究阴道疾病以及开发和测试潜在治疗干预措施的工具。

摘要

女性健康，尤其是女性生殖道（FRT）疾病，一直未获得应有的关注，尽管生殖系统异常可能导致危及生命的疾病、不孕或妊娠不良结局。该领域的一个障碍在于，目前缺乏能够真实模拟女性生殖道生理及病理生理状态的临床前实验模型。现有 体外 动物模型无法完全重现激素变化、微需氧环境以及与阴道微生物组的相互作用。器官芯片（Organ-on-a-Chip，Organ Chip）微流控培养技术的出现为解决这一问题提供了潜在方案，该技术能够模拟人体器官主要功能单元的组织-组织界面、血管灌注、间质液流动以及物理微环境。近期已开发出一种人源阴道芯片（Vagina Chip），可实现人源阴道微生物群落与原代人阴道上皮的共培养，并与阴道间质组织形成界面，同时施加动态流体流动。该芯片能够模拟人阴道在健康与菌群失调微生物组条件下的生理响应。本文详细描述了构建人源阴道芯片的具体实验方案。

引言

以Lactobacillus spp. 为主导的阴道微生物组有助于维持酸性微环境，在维护女性生殖健康方面发挥着重要作用¹。然而，有时构成微生物组的微生物群落组成会发生变化，导致阴道细菌多样性增加。这种生态失衡常表现为从以Lactobacillus为主的状态转变为由更多 样化的厌氧菌物种（例如Gardnerella vaginalis）主导的状态，与多种生殖系统疾病相关，如细菌性阴道病、萎缩性阴道炎、尿路感染、外阴阴道念珠菌病、尿道炎和绒毛膜羊膜炎^{2，3，4，5}。这些疾病反过来会增加女性感染性传播疾病和盆腔炎性疾病的风险^{6，7，8，9}。此外，它们还会增加孕妇早产和流产的风险^10，11，

方案

本研究严格遵守机构关于人类细胞使用的规定。细胞购自商业来源（参见材料表）。所有步骤均须在生物安全柜（BSC）中无菌操作。本实验方案仅使用带滤芯（或屏障）的移液器吸头。

1. 培养人阴道上皮细胞

1. 将50 mL阴道上皮细胞培养基（VEM，参见材料表）预热至37 °C。
2. 取9 mL VEM加入15 mL离心管中。随后，解冻一管人阴道上皮细胞（HVECs），并将其加入含有VEM的离心管中。
3. 在室温（RT）下，以300 × g 离心15 mL离心管5分钟，吸除上清液，保留沉淀。
4. 用2 mL VEM轻柔重悬沉淀，将1 mL细胞悬液分别加入两个已含有14 mL VEM的T75培养瓶中。
5. 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂ 条件下培养。每2天更换一次VEM，直至HVECs融合度达到约70%（约5天）。

2. 培养人子宫成纤维细胞

1. 在双蒸水（ddH₂O）中配制10 mL浓度为15 μg/mL的聚-L-赖氨酸溶液（PLL）。向两个T75培养瓶中各加入5 mL PLL溶液，37 °C孵育1小时。
....

结果

人类阴道由复层上皮构成，其下方为富含成纤维细胞的胶原结缔组织基质。为模拟这一结构，可在双通道微流控器官芯片装置中，将原代人阴道上皮细胞和成纤维细胞分别培养于同一多孔膜的两侧，从而构建组织界面。通过明场显微成像监测阴道上皮的形成过程，可观察到细胞逐渐形成连续的单层，并进一步发育为多层细胞结构（图2A）。既往研究已证实，从横切面观察，该形态特征与完全分层的上皮结构发育相对应²⁹。然而，若上皮层呈现斑块状且不连续（图2B），则该阴道芯片可能不适合用于实验。

图3 展示了阴道芯片（Vagina Chip）构建过程的示意图。为了验证阴道芯片的功能，将芯片分别接种 L. crispatus 和 G. vaginalis，以模拟健康的和菌群失调的阴道环境。其中，G. vaginalis 是细菌性阴道病的主要致病菌。为了.......

讨论

以往的人体阴道 体外 模型无法真实再现阴道组织结构、液体流动以及宿主与病原体之间的相互作用^19,22。动物模型也因不同物种间微生物组的差异以及动情周期或月经周期的不同而受到限制^19,22。本文描述了一种构建人源阴道类器官芯片模型的实验方案，该模型可有效模拟人体对健康及失调微生物群落的反应。

本方案涉及在商用双通道器官芯片装置（参见材料表）中，于分隔平行微通道的共用多孔膜两侧分别接种阴道上皮细胞和成纤维细胞。该多孔膜允许生长因子及其他形式的细胞间信号分子迁移，而胶原涂层及细胞单层的存在则可防止通道间培养基的混合。当顶腔通道中形成阴道上皮细胞单层后，向基底通道流动的培养基中加入分化因子，这些因子穿过间质空间，从而促进阴道上皮细胞分化，形成复层上皮结构。接种时阴道上皮细胞的密度是决定分化阶段结束时阴道芯片.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	用于培养基脱气
双通道芯片	Emulate	BRK-S1-WER-24	双通道芯片试剂盒的组成部分
200 μL 封堵吸头（或滤芯吸头）	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	用于芯片接种的吸头
活化试剂1（或ER-1粉末）	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	双通道芯片试剂盒的组成部分；储存温度 -20 °C
活化试剂2（或ER-2溶液）	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	双通道芯片试剂盒的组成部分；储存温度 4 °C
腺嘌呤	Sigma Aldrich	A2786	分化培养基的组分
布鲁氏菌血琼脂平板	VWR International Inc.	89405-032	含血红素和维生素K；用于阴道加德纳菌的计数
无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS（DPBS (-/-)）	ScienCell	303	用于细胞洗涤
氯化钙	Sigma Aldrich	C5670	分化培养基的组分
氯化钙（无水）	Sigma Aldrich	499609	HBSS（LB/+G）的组分
胶原蛋白I型	Corning	354236	用于HVEC的包被溶液
胶原蛋白IV型	Sigma Aldrich	C7521	用于HVEC的包被溶液
胶原酶IV	Gibco	17104019	用于从阴道芯片中解离细胞
完全成纤维细胞培养基	ScienCell	2301	用于HUF培养的培养基
完全阴道上皮培养基	Lifeline	LL-0068	用于HVEC培养的培养基
D-葡萄糖（右旋糖）	Sigma Aldrich	158968	HBSS（LB/+G）的组分
DMEM（低葡萄糖）	Thermofisher	12320-032	分化培养基的组分
动态流控模块（或Zoë）	Emulate	Zoë-CM1	调节芯片的流速
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	分化培养基的组分
热灭活胎牛血清	Thermofisher	10438018	分化培养基的组分
人子宫成纤维细胞	ScienCell	7040	HUF
人阴道上皮细胞	Lifeline	FC-0083	HVEC
氢化可的松	Sigma Aldrich	H0396	分化培养基的组分
ITES	Lonza	17-839Z	分化培养基的组分
L-谷氨酰胺	Thermofisher	25030081	分化培养基的组分
六水合氯化镁	Sigma Aldrich	M2393	HBSS（LB/+G）的组分
七水合硫酸镁	Sigma Aldrich	M1880	HBSS（LB/+G）的组分
MRS琼脂平板	VWR International Inc.	89407-214	用于乳酸杆菌的计数
磷酸乙醇胺	Sigma Aldrich	P0503	分化培养基的组分
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Thermofisher	15070063	分化培养基的组分
pH试纸	Fischer-Scientific	13-640-520	用于pH值测定
芯片模块（每芯片1个）	Emulate	BRK-S1-WER-24	双通道芯片试剂盒的组成部分
聚-L-赖氨酸	ScienCell	403	用于HUF的包被溶液
氯化钾	Sigma Aldrich	P3911	HBSS（LB/+G）的组分
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	P0662	HBSS（LB/+G）的组分
无菌80%甘油	MP Biomedicals	113055034	用于细菌样本的冷冻保存
三碘甲腺原氨酸	Sigma Aldrich	T6397	分化培养基的组分
台盼蓝溶液（0.4%）	Sigma Aldrich	T8154	用于活/死细胞计数
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	用于从阴道芯片中解离细胞
胰蛋白酶中和液（TNS）	ScienCell	113	用于中和胰蛋白酶
胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%）	ScienCell	103	用于细胞解离
β-雌二醇	Sigma Aldrich	E2257	分化培养基中的激素